前言早产儿慢性肺疾病（CLD）是早产儿在肺发育未成熟的基础上，因高氧、感染，气压伤等原因引起肺部的远期合并症。早产儿CLD作为早产儿肺透明膜病治疗的并发症在1967年首次被Northway描述，也称为支气管肺发育不良（BPD）。氧疗法是患有心肺疾病的早产儿最常应用的一种治疗手段。这一措施虽可改变患儿的低血氧状态、挽救患儿的生命，但长期吸入高浓度的氧气，可引起不同程度的肺损伤，严重者可发展为CLD。随着新生儿医学的不断发展，重症抢救技术水平的提高，使得CLD的发病率呈逐渐增高趋势（30％～40％）。由于目前尚无有效的预防和治疗方法。高氧后早产儿CLD已成为NICU最为棘手的问题之一。目前CLD发生机制的研究已成为国内外研究的热点之一，虽然大量临床和动物实验从氧化应激性肺损伤、炎症反应、细胞凋亡和某些生长因子不足介导的肺发育障碍等诸多角度阐明了CLD的发生和发展过程，但其确切的发生机制仍不详。不论病因如何，CLD的特征性病理改变是肺发育受阻和肺间质纤维化。早产儿CLD目前尚无有效的治疗方法，早在上世纪90年代糖皮质激素是预防和治疗的治疗早产儿CLD的常规用药，用来减轻肺水肿、局部炎症反应并减少患者对氧的依赖程度，但越来越多临床研究表明：糖皮质激素影响肺分支发育、脑发育和体格发育，已很少应用。早期预防性应用表面活性物质替代疗法可改善肺功能，但不能降低CLD的发病率。因此研究其发病机制，寻求如何逆转高氧诱导的肺泡发育阻滞、减轻肺间质广泛纤维化、减少新生儿CLD发生成为新生儿医生面临的一个紧迫待解决的课题。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是作用于血管的辛肽化合物，由于其通过收缩血管和钠潴留来控制血压和容量自体稳定而一直受到关注。研究发现，在许多组织中存在局部的RAS能独立于循环系统产生AngⅡ的前体，并发现AngⅡ在组织损伤、纤维化过程中可能扮演重要的角色。体外实验证实AngⅡ通过AT1R促进培养的肺泡上皮细胞（AEC）调亡；刺激肺FB自分泌TGF-β1进而促进FB增殖和分化、胶原沉积；还有人认为AngⅡ可能通过与AT1R结合通过调控MMPs/TIMPs的合成及活化、参与组织重塑的过程；另外肺循环或肺实质内激活的局部RAS系统还能通过增加血管渗透性、增加血管紧张度等多个机制参与肺损伤的发生。应用ACEI和AT1R拮抗剂能够减轻博莱霉素诱导肺纤维化的进展。推测肺局部的RAS在肺纤维化发病过程中具有重要的作用。关于RAS系统在高氧致新生大鼠CLD发病中的作用研究尚少。Li研究发现在高氧刺激后新生大鼠肺组织中AngⅡ和ACE水平上升，并且应用开博通可减轻肺纤维化。但其确切机制不清。本研究计划将新生鼠暴露于85％高氧环境发病中，制造CLD的动物模型，同时给特异性AT1R拮抗剂losartan干预，通过组织病理、形态学分析并且进一步从蛋白、基因水平等方法进行检测，从肺局部RAS的受体水平来研究在高氧致新生大鼠CLD发病机制，探讨losartan抗肺纤维化可能的作用机制，为寻求早产儿CLD的治疗提供新思路。实验材料与方法一、动物模型本实验是在中国医科大学盛京医院实验动物中心完成。足月新生Wistar大鼠（连同母鼠）被随机分为4组：AIR组、空气对照组；O₂组、单纯高氧暴露组；AO₂组、高氧+注射用水组；LO₂组、高氧+losartan组。将2-4组在生后24 h内置于玻璃氧舱中，持续输入氧气，维持在FiO₂ 0.85，每日两次监测氧浓度（美国OM-25ME型测氧仪监测），用钙石灰吸收CO₂，使其浓度小于0.5％（美国Dapex气体分析仪），温度20℃～25℃，湿度50％～70％，每天开箱0.5h，称重，添加水及饲料，更换垫料，与空气组互换母鼠以避免母鼠因氧中毒而致护理能力降低；空气对照组置于空气中（FiO₂ 0.21），饲养条件与高氧组相同。3、4组于生后6d每天分别经胃管灌服注射用水（3ml/kg）、losartan（5mg/kg/d，注射用水3ml/kg配成混悬液），直至实验结束。二、标本采集和处理每组分别于实验开始后的第1、3、7、14、21天分别从中随机抽取8只，腹腔注射5％水合氯醛6ml/kg麻醉后处死。立即打开胸腔，无菌条件下分离肺组织，取右肺各叶置于无Rnase的Eppendorf管中于-80℃冰箱中保存。取左肺置于0.1％DEPC的4％多聚甲醛（0.1MPBS，pH7.0～7.6）固定，常规脱水、石蜡包埋。三、实验方法（一）、一般状况观察动态观察各组新生大鼠的一般状态和死亡情况、监测体重，并比较时点生存率和生存曲线。（二）、病理形态学研究1、光镜观察：切片进行常规HE染色，光镜下动态观察肺组织的病理改变。2、肺泡间隔厚度测定：3、Masson三联染色动态观察肺组织内的胶原纤维沉积。（三）、采用免疫组化、RT-PCR检测肺组织AT1R的表达（四）、各组胶原蛋白含量和基因表达的动态变化1、免疫组化方法检测肺组织α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在肺组织中表达的强度和部位。2、酸解法检测肺组织羟脯氨酸的含量，间接反映肺组织胶原的含量。3、酶联免疫吸附法（ELISA）动态检测肺组织Ⅰ型胶原蛋白（ColI）的含量变化。4、RT-PCR技术检测肺组织ColI mRNA的表达。（五）、采用免疫组化、RT-PCR技术检测肺组织MMP-13和TIMP-1表达的变化四、统计学分析应用SSPS 11.5统计软件进行统计学处理，数据以均值±标准差（（?）±s）表示，多组间比较采用方差分析（F检验）。两样本均数间比较采用Independent t test。相关性分析；生存率的估计使用寿命表法，时点生存率的比较用u检验。结果以P<0.05有意义。结果一、高氧及Losartan干预后新生大鼠一般状态和生存率的变化O₂组新生鼠一般在5～7d后出现少动、呼吸急促、皮肤苍白以及离氧后不同程度的发绀，随高氧暴露时间延长而逐渐加重，在10d后出现对氧的依赖。LO₂组新生大鼠在离氧后的耐受能力好于高氧组。而AIR组则无以上异常表现。随着高氧暴露时间的延长，O₂组新生大鼠生存率下降（P<0.05）；其中LO₂组新生大鼠存活率较O₂组增加；AO₂组同于O₂组；而AIR组，1天后无死亡。O₂组在高氧暴露7d开始，新生大鼠体重与AIR组相比下降（P<0.05），随着高氧暴露时间的延长，体重差异逐渐明显（P<0.01）。LO₂组体重与单纯O₂组相似。二、各组新生大鼠肺组织病理形态学变化的比较（一）肺组织的病理改变：AIR组1d的肺组织出现小而浅的原始肺泡，形态不规则，肺泡间隔较厚；3d时终末气腔大小降低，数量渐增多，肺泡间隔渐薄；7d-21d肺泡化进一步完善，到21d肺泡间隔变薄，肺泡次级隔明显增多，肺泡数量增多，形态较规则；O₂组在高氧暴露1d后与AIR组无明显差别。3d可见小血管扩张、充血，肺泡腔内或间隔少量出血，以中性粒细胞为主的渗出、间质内细胞增多。7d时炎症反应进一步加重，肺泡间隔水肿变宽，出现终末气腔扩张、肺泡融合、肺泡分隔减少等。14d-21d间隔增宽，小灶或多灶状实变，肺组织正常结构破坏，且终末气腔扩张更为明显、小肺泡数量更少，肺泡次级隔明显减少。AO₂组与O₂组改变相似。而LO₂组在7d与高氧组区别不明显，14d、21d肺组织肺泡间隔变薄、纤维化程度明显减轻，但肺泡腔没有明显缩小，且肺泡次级隔仍较少。（二）Masson染色：蓝色的胶原纤维主要在支气管及血管壁的外周，肺泡壁有少许。O₂组随高氧时间的延长，胶原纤维在在支气管及血管壁的外周沉积增加；在高氧后14d、21d肺泡间隔蓝色胶原纤维所占比例较AIR组明显增加。LO₂组蓝色胶原纤维所占比例较O₂组减少且排列比较疏松，但仍明显高于AIR组。三、高氧对CLD新生大鼠肺组织AT1R表达的影响AT1R主要在肺泡上皮细胞、间质细胞、间质巨噬细胞、血管内皮细胞和血管平滑肌细胞、支气管和毛细血管外膜有免疫染色；AIR组3d表达增强，之后表达显著下降，21d仅在肺泡上皮细胞及血管外膜弱表达；而O2组在21d在损伤部位的间质巨噬细胞、FB仍有较强的免疫染色。O2组在1d、3d、7d AT1R蛋白和mRNA表达与AIR组无明显差别（P>0.05），14d和21d时较同期AIR组表达显著增强（P<0.01），四、各组胶原蛋白含量和基因表达的动态变化（一）α-SMA在肺组织中的表达免疫组化结果示：AIR组肺组织，α-SMA表达部位主要在肺血管、气道壁及呼吸性支气管开口处平滑肌的胞浆中，同时1d-7d在初级肺泡隔间质中表达，到14d、21d时在次级隔顶端有免疫染色。O₂组7d后，α-SMA在管壁平滑肌中表达明显增强，同时在肺泡间隔有明显表达；到14d、21d在肺泡表面、间质出现弥漫性强的免疫染色。LO₂组α-SMA表达的范围和强度较O₂组明显减弱。（二）酸解法检测肺组织HYP的含量在1d-7d各组HYP的含量没有明显的区别。14d和21d O₂组肺组织HYP的含量明显高于同期AIR组（P<0.01），AO₂组改变同于高氧组；LO₂组HYP的含量在14d较O₂组略有下降，但差异不明显，到21d则较O₂组下降显著P（0.01），但仍明显高于AIR组（P<0.01）。（三）检测各组肺组织ColI蛋白及mRNA表达的变化AIR组ColI的含量均随日龄增加逐渐下降，而高氧各组逐渐增加（P<0.01）。14d O₂组较AIR组显著上升（P0.01），21d时差异更为显著（P<0.001）；Losartan干预后14d较高氧组略有下降，但差异不明显，21d时则显著下降（P<0.01）。AIR组各时间点ColImRNA表达无明显差异（P>0.05）。O₂组和AO2组ColImRNA表达随日龄的增加显著上升，7d差异显著（P<0.01），21d时达高峰。LO2组在21d时较O₂组显著下降（P<0.01）。肺组织α-SMA表达与ColImRNA之间呈较强直线相关关系（r=0.64，P<0.05）；而与ColI蛋白无直线相关关系（r=0.28，P>0.05）。五、各组新生大鼠MMP-13和TIMP-1在肺组织表达的变化（一）MMP-13和TIMP-1在肺组织中的蛋白表达比较AIR组肺组织MMP-13和TIMP-1的表达部位主要在上皮细胞、毛细血管内皮和间质细胞胞浆中。在AIR组各时间点MMP-13表达没有明显的变化（P>0.05）；O2和AO2组1d-14d与AIR组无明显差异（P>0.05）；到21d MMP-13表达显著下降（P<0.01）。LO2组在21d较O2和AO2组表达均明显增强（P<0.01），与AIR组相近（P>0.05）。TIMP-1在高氧7d后增强，14d和21d更为显著（P<0.01）；Losartan在21d抑制高氧肺组织TIMP-1表达（P<0.01），但仍高于AIR组（P<0.05）。（二）MMP-13和TIMP-1在肺组织中的mRNA表达比较各组肺组织均有MMP-13，TIMP-1 mRNA表达；且mRNA表达与蛋白表达变化趋势具有一致性。结论1、新生大鼠持续高浓度氧气暴露，可导致新生大鼠肺组织出现肺泡发育障碍和肺纤维组织增生等病理形态学改变，符合早产儿CLD的发生发展特点和解剖学改变。2、新生大鼠肺组织AT1R主要定位在肺泡上皮细胞、间质细胞、间质巨噬细胞、支气管和毛细血管外膜；高氧组在内皮细胞、支气管上皮细胞出现阳性染色。AT1R在高氧后期表达明显增强，与肺纤维化发生时间一致性的结果提示AngⅡ作为AT1R配体可能参与高氧CLD的发生。3、在高氧暴露的中晚期，在肺泡腔的表面及间质内出现弥漫性、条索状α-SMA表达，而在空气对照组α-SMA在次级隔的顶端呈点状表达，而在肺泡腔和间质内却罕见表达。推测持续高浓度氧气暴露诱发肺组织MFB表达部位及表达的强度的改变可能是CLD发生的主要原因之一。4、Losartan可明显降低高氧致CLD新生大鼠肺组织α-SMA、Col蛋白和mRNA的表达，降低肺组织HYP的含量；α-SMA与ColI mRNA表达具有显著相关性结果，提示Losartan可能通过抑制肺组织MFB的转化，进而抑制ColI mRNA的表达来减轻高氧CLD新生大鼠肺纤维化。结果同时暗示高氧致新生大鼠肺组织纤维化的发生可能通过AngⅡ与AT1R结合，调节ColI合成来介导完成的。5、MMP-13和TIMP-1在正常肺组织有表达，提示MMP-13和TIMP-1可能在参与肺的形态构建，胶原代谢等过程。6、在高氧晚期肺组织mmp-13基因和蛋白表达显著下降；而TIMP-1表达明显增强。猜测在高氧暴露晚期MMP-13/TIMP-1mRNA和蛋白表达失衡导致胶原降解减弱，这可能是高氧后期以ColI为代表的肺组织ECM异常沉积的关键所在。7、Losartan可显著诱导高氧肺组织MMP-13mRNA和蛋白表达，下调TIMP-1mRNA和蛋白的表达，使得MMP-13/TIMP-1比值得到部分纠正，减少高氧肺组织中ColI的异常沉积。提示：肺局部AngⅡ可能通过与AT1R结合，通过调节MMP-13/TIMP-1的合成与活性来参与高氧CLD的发生。