第一部分高糖高脂膳食所致的IETM诱发大鼠MS目的:探讨高糖高脂膳食所伴发的IETM在大鼠MS中的作用。方法:48只雄性SD大鼠适应性喂养1周,随机分为对照组(NC)和模型组(HSHF),每组24只,NC组喂以正常膳食,HSHF组喂以高糖高脂膳食(0.25%cholic acid+1%cholesterol+10%sucrose+20%lard+70%normal fodder)。每组动物再随机分为三组,NC:6月,9月,12月,每组8只;HSHF:6月,9月,12月,每组8只。各组动物分别于实验第6月末、第9月末、第12月末进行相应的处理:在麻醉状态下,腹主动脉取血并分离血浆;无菌条件下取肾周和附睾脂肪组织称重;断头处死,迅速取脑,于冰上分离两侧海马及皮层,一半置于10%的中性福尔马林固定,常规制片备用;一半铝箔纸包好液氮速冻,随后放入-80℃冰箱备用。1.检测血浆中MS相关指标的变化采用酶法测定血浆甘油三酯(TG)、甘油二酯(DAG)、游离脂肪酸(FFA)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、总胆固醇(TCH)、血糖(FPG)及胰岛素(FIN)水平。计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),公式为:HOMA-IR=FPG×FIN/22.5。2.检测血浆中炎症相关因子的变化采用鲎试剂显色法检测血浆中内毒素(LPS)水平;采用ELISA试剂盒检测血浆中TNF-α、IL-6及IL-1的变化。结果:实验期间,NC及HSHF组大鼠均状况良好,各阶段HSHF组大鼠较NC组大鼠体重及Lee’s指数明显增加(P<0.05),内脏脂肪占体重百分比也明显增加(P<0.05),提示HSHF组大鼠出现肥胖。1.血浆中MS相关指标的变化HSHF组大鼠各阶段血浆中TG、TCH、DG、FFA、LDL、FPG、FIN水平均明显升高(P<0.05),HDL水平则显著降低(P<0.05)。提示经过高糖高脂膳食喂养后,动物出现了糖代谢紊乱及异常脂蛋白血症。2.血浆LPS及促炎因子的变化HSHF组大鼠血浆LPS在6月就有明显的升高,且在整个实验过程中,LPS一直处于高水平状态,与NC组相比差异具有显著性(P<0.001);TNF-α、IL-1及IL-6水平在不同阶段较NC组也有不同程度的升高(P<0.05)。结论:1.高糖高脂膳食可诱导大鼠出现肥胖、糖耐量异常、异常脂血症等,提示动物发生了MS。2.高糖高脂膳食诱导的IETM所致的慢性低度炎症、脂质异地蓄积与IR可能是MS发生的基础。第二部分IETM在MS相关疾病AD发生发展中的作用研究目的:探讨高糖高脂膳食诱发的IETM是否会导致大鼠AD样改变及其在此过程中所起的作用。方法:动物分组与处理同实验一。1.检测脑组织中AD标志性蛋白的水平采用Western blot方法检测海马Tau蛋白磷酸化水平;采用ELISA试剂盒检测皮层及海马Aβ含量。2.脑组织病理检测皮层和海马H&E染色,观察脑组织病理学变化。3.AD相关基因检测采用PCR法检测脑组织中AD相关基因BACE、APOE4、IDEm RNA的表达。4.脑组织炎症相关指标的检测ELISA法检测脑组织中DAG、FFA、TNF-α、IL-6、IL-1水平的变化;血浆LPS水平检测;ELISA检测血浆中MCP-1的变化;免疫组化法检测脑组织CD68表达;免疫荧光法检测小胶质细胞OX-42的表达。采用IPP6.0软件分析CD68及OX-42免疫反应阳性细胞数。5.脑组织胰岛素抵抗水平检测Western blot法检测中枢胰岛素信号转导相关蛋白JNK、PI-3K、AKT、GLUT、GSK-3β等水平。6.脑细胞凋亡水平检测脑细胞凋亡采用TUNEL试剂盒,原位杂交二步法进行检测。采用IPP6.0软件分析细胞凋亡率。结果:1.脑组织中AD标志性蛋白的变化HSHF组大鼠海马Tau蛋白199位点的过度磷酸化在6月就表达增加,一直持续到12月(P<0.01);Tau蛋白396位点的磷酸化在6月时表达不是十分明显,但9月、12月均异常升高(P<0.01);Tau蛋白212位点的过度磷酸化随着时间的推移表达逐渐增加,其较NC组相比,差异具有显著性。HSHF组大鼠皮层及海马Aβ含量在各个阶段均明显升高,其差异具有显著性(P<0.05)。2.脑组织病理学变化HSHF组大鼠脑组织皮层及海马在6月均出现少量炎细胞的浸润,小胶质细胞及淋巴细胞增生,后逐渐加重,持续到12月炎性细胞浸润最为明显。3.A D相关基因变化HSHF组大鼠海马组织IDE m RNA表达随着时间的推移逐渐降低,到12月表达明显减少;而APOE4、BACE基因m RNA表达均较NC组明显升高,其差异具有统计学意义。4.脑组织炎症相关指标的变化HSHF组大鼠6月、9月、12月脑组织DAG、FFA、TNF-α、IL-6、IL-1均显著升高(P<0.001,P<0.05);血浆中LPS、MCP-1等均明显升高,其差异具有统计学意义(P<0.001);脑组织免疫组化结果显示,HSHF组大鼠在各个阶段CD68表达均明显增加;小胶质细胞被激活,随着时间的推移活化程度逐渐加重。5.脑组织胰岛素抵抗状态的改变HSHF组大鼠脑组织海马p-JNK、p-PI-3K、p-AKT、GLUT蛋白含量在各个阶段均较NC组明显降低,且随着时间的推移降低更加明显。GSK-3β的含量则表现为随着时间的推移逐渐升高。6.脑细胞凋亡凋亡结果显示,随着高糖高脂膳食喂养时间的延长,HSHF组大鼠脑组织中会出现大量的细胞凋亡,其较NC组相比,具有统计学意义。结论:1.高糖高脂膳食所致模型组大鼠发生MS时始终伴有IETM,且其脑组织可表现出AD的特征性改变,成功构建了MS相关AD的动物模型。2.IETM在引起外周慢性低度炎症、脂质异地蓄积及胰岛素抵抗的同时也会导致脑组织出现同样的改变。3.AD的发生与脑内慢性炎症、脂质蓄积及胰岛素抵抗有密切关系。第三部分IETM启动MS相关疾病AD的基本机制目的:探讨IETM启动MS相关疾病AD的基本机制。方法:动物分组与处理同实验一。1.血浆中氧化应激相关因子的检测ELISA法检测血浆中丙二醛(Maleic Dialdehyde,MDA)的含量。2.免疫荧光法检测脑组织活性氧水平取出液氮冻存的脑组织OCT包埋制备成冰冻块,用冰冻切片机以5um厚度连续切片,将DHE工作液滴加于冰冻切片上,荧光显微镜下观察脑组织ROS水平。3.Western blot法检测内质网应激相关蛋白的表达取冻存的脑组织Western blot法检测GRP78、CHOP蛋白的表达。4.ELISA测定脑组织匀浆FFA、DAG的含量。结果:1.HSHF组大鼠血浆MDA水平与NC组相比显著升高,且脑组织中ROS含量明显增加,随着时间的推移,ROS增加更为明显。2.Western blot检测GRP78与CHOP,GRP78结果显示HSHF组在6月,9月逐渐升高,9月达到最大值,12月有所下降但仍高于NC组;CHOP在NC组几乎不表达,HSHF组随着时间的推移表达逐渐增加,到12月达到最大值。3.HSHF组动物脑组织匀浆FFA、DAG含量明显增高,提示脑组织出现脂质异地蓄积,进而导致脂毒激活了内质网应激。结论:1.IETM所致的氧化应激与内质网应激可能是所有代谢性疾病发生的基本机制。2.AD的发生机制与MS发生机制基本一致,可以初步认为AD也属于MS相关疾病。综上所述,本研究得出以下结论:1.高糖高脂膳食喂养大鼠可伴随IETM的发生,且程度逐渐加重;IETM可导致MS相关疾病的发生。2.IETM所致慢性低度炎症、脂质异地蓄积、IR是MS与AD发病的共同机制,可以初步认为AD也属于MS相关疾病。3.IETM所致的氧化应激与内质网应激可能是所有代谢性疾病的基本机制。