实验目的：眼部疾病如眼内肿瘤、外伤性视神经损伤、干眼、葡萄膜炎、糖尿病视网膜病变、老年性黄斑病变等，往往需要长期、多次反复给药。由于眼球具有相对封闭的结构特性，全身给药难以达到治疗浓度。频繁地局部注射容易造成视网膜脱离、眼内感染、玻璃体内出血、眼压升高等。因此，设计一种具有药物缓释功能的载药体系，减少用药频率，增加药物生物利用度在眼内疾病的治疗中显得尤为关键。壳聚糖（CS）是无毒、可降解天然多糖，是优良的生物医用材料。本研究拟制备壳聚糖基纳米粒和温敏型水凝胶作为药物载体，分别用于眼内肿瘤抑制和视神经损伤修复。本研究主要分为以下两部分：
　　第一部分、壳聚糖基载阿霉素（DOX）纳米粒抑制脉络膜黑色素瘤研究
　　实验方法：脉络膜黑色素瘤是主要的原发性眼内恶性肿瘤，在成人中发病率较高。由于其高表达legumain的特性，我们通过一段legumain能够水解的多肽（PEP）将DOX桥接至CS骨架上，形成带正电CS修饰DOX前药（CS-PEP-DOX）。利用聚乙二醇末端氨基诱导谷氨酸-N-环内酸酐开环聚合，形成聚乙二醇-聚谷氨酸苄酯嵌段共聚物（PEG-PBG），并进一步在碱性条件下去除苄基，生成聚乙二醇-聚谷氨酸（PEG-PGA）。由于多肽的两性解离性质，PGA部分在pH＞3.0的缓冲液体系中带负电。我们将CS-PEP-DOX与PEG-PGA在MES缓冲液（pH5.0）中混合，电荷驱动下自组装形成legumain响应型载DOX纳米粒。利用1H-NMR进行分子结构分析，利用激光粒度仪（DLS）、透射电子显微镜（TEM，TecnaiG2F20S-TWIN,FEI）进行粒径和形貌特征分析。利用差示扫描量热法（DSC，TAInstruments）表征热力学性质。我们进一步用CCK-8试剂盒法进行纳米粒抑制脉络膜黑色素瘤细胞（Mum-2c）效果评价和对正常角膜上皮细胞（HCEC）生物毒性评价。并用激光共聚焦显微镜（CLSM，Leica，Germany）和流式细胞仪进一步分析肿瘤细胞和正常细胞对该载药纳米粒的摄取行为。
　　实验结果：1H-NMR分析PEG-PBG和PEG-PGA化学结构，表明成功制备了PEG-PBG和PEG-PGA。DLS及TEM结果表明，随着PEG-PGA含量增加，逐渐形成形态规整的纳米粒。细胞实验表明，相较与游离DOX，DOX纳米粒对Mum-2c明显具有更强的抑制作用，且对正常细胞毒副作用更低。细胞摄取实验表明，纳米粒能够显著促进细胞对药物的摄取。
　　实验结论：利用电荷驱动自组装，在水相体系中制备了CS基纳米粒。DOX和CS通过legumain底物肽进行结合，使其具有legumain响应释放的特性。初步研究结果表明，载药纳米粒比游离药物具有较高的抗癌活性和较低毒副作用。
　　第二部分、壳聚糖基温敏型水凝胶用于家兔视神经损伤修复研究
　　实验方法：应用透析法，将FK506和PEG-PBG共混后透析制备FK506纳米胶束。DLS法测定纳米胶束的粒径、电位、多分散系数。我们进一步制备CS温敏型水凝胶，并将FK506纳米胶束与睫状神经生长因子（CNTF）共包载进温敏型水凝胶内。用SEM观察水凝胶的形貌、结构特征。CCK-8试剂盒法评价水凝胶材料对原代视网膜神经节细胞（RGC）的细胞毒性作用。我们进一步制作视神经损伤动物模型，评估载药水凝胶对视神经损伤动物RGC保护效果。实验主要分为3组，每组3只实验动物。正常对照组：随机抽取3只，不做处理；损伤治疗组：视神经夹伤后注射0.2mL包载药物的水凝胶；损伤对照组：视神经夹伤以后加入0.2mLPBS。伤后14d处死动物，进行苏木精-伊红（H&E）染色和凋亡细胞（TUNEL）检测，在荧光显微镜下观察各处理组的情况。
　　实验结果：应用DLS测定FK506胶束的粒径约为200nm,PDI在0.1左右。用酶标仪测定不同体积比例的水凝胶作用于RGC时细胞活力值，结果显示在实验设定的浓度范围内（1、0.5、0.25mg/mL），水凝胶未表现出对RGC细胞明显的毒性。H&E染色结果显示正常组视网膜三层细胞分界清楚。而损伤组视网膜各层细胞排列紊乱，细胞间隙增大，且视神经结构不完整，在夹伤处，可见空泡样变性。相比损伤对照组（PBS处理组），损伤治疗组具有较小的空泡样变性，细胞凋亡较少。表明其有一定程度的治疗效果。
　　实验结论：我们制备的包载FK506胶束/CNTF温敏凝胶缓释体系，能够在一定程度上抑制外伤性视神经损伤后继发性RGC凋亡，在视神经损伤修复方面表现出一定的潜力，为治疗视神经损伤提供了一种新可能性。