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第一部分:ΔNp63 mRNA和蛋白在膀胱移行细胞癌中的表达目的:探讨ΔNp63 mRNA和蛋白在膀胱移行细胞癌(TCCB)中的表达及意义。方法:逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测24例TCCB患者肿瘤组织、10例对照组膀胱组织ΔNp63 mRNA的表达,SP免疫组织化学法检测43例TCCB患者肿瘤组织、11例对照组膀胱组织ΔNp63蛋白的表达,并分析ΔNp63 mRNA和蛋白表达与TCCB临床分期、病理分级的关系。结果:TCCB组织中ΔNp63 mRNA和蛋白表达的阳性率分别为75.0%(18/24)和100%(43/43),正常膀胱组织中ΔNp63 mRNA和蛋白表达的阳性率分别为0.0%(0/10)和18.2%(2/11), TCCB组ΔNp63 mRNA和蛋白表达的阳性率明显高于正常组,差异有显著性(p<0.05)。不同临床分期和病理分级肿瘤组织中ΔNp63 mRNA和蛋白表达的阳性率及强度,各组间差异无显著性(p>0.05)。结论:TCCB组ΔNp63 mRNA和蛋白表达水平均明显高于正常组,提示ΔNp63与TCCB的发生密切相关,可能为TCCB的一个癌基因。不同临床分期和病理分级肿瘤组织中ΔNp63 mRNA和蛋白表达的阳性率及强度,各组间差异无显著性,提示ΔNp63 mRNA和蛋白表达水平和TCCB的临床分期、病理分级没有明显相关性,故ΔNp63在TCCB进展中的作用有待进一步研究。第二部分:ΔNp63特异性shRNA表达质粒的构建目的:构建并筛选△Np63特异性短发卡RNA(shRNA)表达质粒,初步检测其对TCCB 5637细胞中△Np63基因的沉默作用。方法:设计合成两对ΔNp63 shRNA短链寡核苷酸,克隆到Pgenesil-1质粒载体中,构建ΔNp63特异shRNA表达质粒,在转染试剂介导下转染5637细胞,六孔板每孔加入0.4μg质粒。半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测其对ΔNp63基因表达沉默作用,筛选出最有效的重组质粒。结果:经PstI+SalI双酶切及测序鉴定ΔNp63-shRNA表达质粒构建成功,成功筛选出最有效的阳性重组质粒(ΔNp63-shRNA表达质粒),ΔNp63-shRNA表达质粒能够有效沉默ΔNp63基因的表达,抑制率63.0%。结论:成功构建ΔNp63-shRNA表达质粒,ΔNp63-shRNA表达质粒能够成功转染5637细胞,并可特异性沉默5637细胞中ΔNp63mRNA的表达。第三部分:△Np63特异性shRNA在膀胱移行细胞癌中的体外效应研究目的:将ΔNp63-shRNA表达质粒转染5637细胞,检测其对5637细胞中ΔNp63基因和蛋白表达抑制,对细胞周期、细胞增殖的抑制作用,检测ΔNp63基因沉默后对cyclinD1和cdk4蛋白表达的影响。方法:利用第二部分设计和筛选的ΔNp63-shRNA表达质粒,转染5637细胞;SP免疫组化检测ΔNp63蛋白表达水平, RT-PCR方法检测ΔNp63 mRNA的表达水平,流式细胞术(FCM)检测细胞周期,四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖活性,SP免疫组化检测cyclinD1和cdk4蛋白表达水平。结果:PstI和SalI双酶切和测序鉴定成功构建ΔNp63-shRNA质粒表达载体,并能够成功转染5637细胞,转染后可显著沉默5637细胞中ΔNp63蛋白和ΔNp63 mRNA的表达,其中ΔNp63 mRNA的表达抑制率为63.0%,转染组G0/Gl期细胞显著增加,S期细胞显著减少,细胞增殖活动明显降低,cyclinD1和cdk4蛋白表达下降。结论:运用ΔNp63-shRNA表达质粒可成功转染5637细胞,有效抑制ΔNp63蛋白和mRNA的表达,并可调控5637细胞的细胞周期、抑制其增殖,ΔNp63可能通过cyclinD1和cdk4调控TCCB细胞周期。第四部分:△Np63特异性shRNA在膀胱移行细胞癌中的体内效应研究目的:建立人膀胱癌裸鼠皮下移植模型,通过沉默ΔNp63基因的表达后,研究其对人膀胱癌裸鼠皮下移植模型的抑瘤作用,同时检测ΔNp63表达沉默后对cyclinD1和cdk4的影响。方法:建立人膀胱癌裸鼠皮下移植模型,将ΔNp63-shRNA表达质粒转染荷瘤鼠瘤体,观察肿瘤生长情况,HE染色和透射电镜检测瘤组织超微结构的改变,观察质粒治疗后瘤组织的病理改变,RT-PCR方法检测ΔNp63基因的表达变化,免疫组化检测cyclinD1和cdk4蛋白表达水平。结果:转染质粒8周后,ΔN p63-shRNA组、Control-shRNA组与生理盐水组比较,ΔNp63-shRNA组与生理盐水组瘤体积有显著性差异(p<0.01),抑瘤率为74.44%,Control-shRNA组与生理盐水组体积无显著性差异(p>0.05)。病理学和透射电镜结果发现:ΔNp63-shRNA组肿瘤生长受到抑制,细胞核分裂相减少,可见大量肿瘤细胞坏死和凋亡、炎症细胞浸润。RT-PCR结果显示ΔN p63-shRNA组ΔNp63基因表达降低,cyclinD1和cdk4蛋白表达下降。结论:ΔNp63-shRNA表达质粒沉默ΔNp63基因后,可显著抑制人膀胱癌裸鼠肿瘤的生长,ΔNp63可能通过cyclinD1和cdk4调控TCCB细胞周期而起到调控肿瘤生长作用。