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microRNA(miRNA)是广泛存在于真核生物体内的一类长度约为21个核苷酸的非编码RNA,其通过与靶基因的mRNA互补配对,降解靶标m RNA或抑制其翻译过程,在生物生长发育过程起重要调控作用。miRNA自发现以来,一直是生命科学领域研究的热点,关于miRNA的生物合成及作用机制已有相当多的报道。近几年研究发现,miRNA是非细胞自主性的,它可以在细胞间及组织间进行运动。为了研究miRNA的运动,前人构建了拟南芥SUC2:amiR-SUL转基因株系,该株系利用韧皮部伴胞细胞特异表达性启动子SUCROSE-PROTON SYMPORTER 2(SUC2)驱动表达人工mi RNA,靶向烟草SULPHUR(SUL)基因在拟南芥中同源的叶绿素合成基因CHLORINA42(CH42),导致叶脉10-15层细胞变白。本研究以SUC2:amiR-SUL株系为材料,采用EMS诱变正向遗传筛选叶脉白斑增大或减小的突变体,发现新的影响miRNA通路的因子。我们选取了一个叶脉白斑减小的突变体SUP-B65,通过stem-loop RT-PCR检测突变体中mi RNA的含量,以及利用荧光定量PCR检测突变体中miRNA的初级转录本(pri-miRNA)与mi RNA靶标基因的表达量。同时将SUP-B65与SUC2:amiR-SUL回交,从F2代中选出与SUP-B65表型一致的植株约60棵,提取它们的基因组样品,将样品混合后送公司进行全基因组重测序以确定突变位点。根据d-CAPs原理针对突变位点设计引物进行基因型鉴定。并且构建回复突变载体,通过回复SUP-B65表型以确定基因型鉴定结果。荧光定量PCR及stem-loop RT-PCR结果表明SUP-B65中的pri-miRNA和miRNA水平相对于SUC2:amiR-SUL均降低,靶标基因的表达水平普遍升高。这说明SUP-B65突变体中受到影响的是miRNA的生物合成,而非miRNA的运动。全基因组重测序共获得4个候选突变位点基因,分别为AT4G11610、AT4G12560、AT5G67030和AT5G67280,基因型鉴定证实突变位点基因为AT4G12560和AT5G67280,这两个基因在拟南芥数据库分别对应CONSTITUTIVE EXPRESSER OF PR GENES 1(CPR1)和ABA DEFICIENT 1(ABA1),说明SUP-B65为cpr1aba1双突变体,进一步的回复突变实验验证了基因型鉴定的结果。已有研究报道,在抗病通路中CPR1负调控SNC1的表达,CPR1突变导致SNC1表达上调,另外ABA1的缺失会导致SNC1积累在核内,因此推测cpr1aba1双突变体表型是由SNC1在细胞核内过量积累造成,并且CPR1基因突变对SUP-B65的表型起到关键作用,ABA1基因突变起到增强的作用。据此推测cpr1aba1双突变体的表型是由SNC1的核定位导致的。后续研究将构建带核定位信号的SNC1载体获得转基因植株,通过进一步的实验确认本研究的推测。