一、组蛋白乙酰转移酶2A(KAT2A)在儿童急性白血病中的作用机制研究目的:以“组蛋白密码”学说为核心的组蛋白调控、组蛋白修饰等均是当前肿瘤研究的新热点。KAT2A是我们以该学说为理论指导,应用自主设计的定量PCR芯片,大样本筛选发现的在儿童急性白血病中显著上调的组蛋白修饰基因。KAT2A基因在儿童急性白血病中的异常表达以及其对白血病细胞凋亡等的影响等均未见报道。方法:应用自主设计的组蛋白修饰基因定量PCR芯片检测30例儿童ALL和27例儿童AML中组蛋白修饰基因的表达谱,分析105例儿童AML临床样本中KAT2A的表达情况以及与各临床参数的关系。使用Annexin-V检测试剂盒分析细胞的凋亡情况,细胞凋亡相关的基因定量PCR芯片检测KAT2A瞬时干扰后变化基因谱,对这些差异基因进行IPA(Ingenuity Pathway Analysis)分析,寻找重要信号通路,利用基因敲除体系敲除AML细胞中KAT2A的表达后对这些细胞进行组蛋白修饰分析。结果:组蛋白修饰基因定量PCR芯片检测30例儿童ALL和27例儿童AML中组蛋白修饰基因的表达谱,发现KAT2A在儿童急性白血病样品中明显高表达。Oncomine基因芯片数据库分析显示该基因在白血病以及多种肿瘤中上调表达。通过检测KAT2A基因表达在儿童急性白血病中的临床意义,实验结果表明KAT2A在儿童AML中的表达明显高于对照非白血病患儿骨髓样本(P<0.01)。进一步的数据分析表明KAT2A高表达患儿的生存时间明显短于低表达患儿(P<0.01),中位生存时间分别为23.7月和41.8月。临床多因素回归分析表明KAT2A的表达可以作为一个独立的预后风险预测因素(P=0.046)。初步阐明KAT2A基因在白血病细胞中发挥的功能,使用Annexin-V检测试剂盒分析细胞的凋亡情况,结果显示KAT2A基因的瞬时干扰可以明显提高HL-60细胞的凋亡比例。细胞凋亡相关的基因检测发现KAT2A瞬时干扰后有24个基因明显上调,37个基因明显下调,通过对这些差异基因进行IPA(Ingenuity Pathway Analysis)分析,建立了基因网络交互模型,整理出候选信号通路及其关键基因。IPA分析显示KAT2A基因对凋亡、增殖等一系列基因的调节作用极有可能通过5个关键信号通路来实现,分别为:NF-κB、MYC、P53、TNF和NR3C1。利用基因敲除体系敲除AML细胞中KAT2A的表达后对这些细胞进行组蛋白修饰分析,实验结果显示组蛋白H3乙酰化修饰的K14以及K9均有明显下降,K14以及K9可能为KAT2A的修饰底物。结论:本研究明确了KAT2A基因异常表达在儿童急性白血病中的临床意义,KAT2A在儿童急性白血病中显著上调,临床多因素回归分析表明KAT2A是儿童AML的独立预后不良风险预测因素;KAT2A调控AML细胞凋亡的功能机制可能与其对组蛋白H3K14和K9的乙酰化修饰有关,本研究为后续研究奠定了重要基础。二、CDK4/6抑制剂LEE011诱导白血病细胞G1期阻滞和细胞衰老的机制研究目的:细胞周期蛋白D1依赖激酶4和6(cdk4/6)的过度表达是包括白血病在内的多种人类肿瘤的共同特征之一。LEE011是CDK4和6的新型抑制剂。到目前为止,LEE011在白血病中的作用机制尚不清楚。方法:通过CCK-8和Annexin V/propidium iodide染色分析,评估LEE011处理后白血病细胞的生长和凋亡。β-galactosidase染色和p16INK4a分子表达分析细胞的衰老。利用Arraystar人Lnc RNA阵列对LEE011处理HL-60细胞的基因表达谱进行了研究。然后用基因本体(GO)和KEGG通路分析方法对聚类分析中不同表达的基因进行分析。结果:LEE011可以抑制白血病细胞的增殖,并可诱导细胞凋亡。Hoechst33342染色分析显示,在LEE011治疗后,细胞核结构发生破碎和变形。细胞周期分析显示,在8个急性白血病细胞中有7个细胞株在LEE011处理后出现细胞周期G1期阻滞。β-Galactosidase染色分析和p16INK4a分子表达分析表明,LEE011处理可以诱导白血病细胞的衰老。Lnc RNA微阵列分析显示,在LEE011处理的HL-60细胞中,出现显著变化的m RNA和lnc RNAs分别达2083个和3224个。分子功能分析显示,LEE011诱导白血病细胞衰老的部分原因可能是对MYBL2转录表达的下调。结论:我们首次论证了LEE011处理对白血病细胞的细胞增殖抑制、G1期阻滞以及细胞衰老的促进作用。Lnc RNA微阵列分析在LEE011-处理HL-60细胞中表现出不同表达的m RNA和Lnc RNAs,我们证明LEE011可能部分通过MYBL2表达下调来诱导细胞衰老。这些结果可以为LEE011诱导细胞衰老的分子机制提供新的研究思路。