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研究目的:乳腺癌是威胁女性健康的主要原因之一。全球每年约有超过1百万的女性被诊断为乳腺癌。流行病学资料显示,饮食因素与乳腺癌的发生发展及预后有着密切关系,这一观点受到越来越多的关注和认可。雌马酚(equol)是植物雌激素经肠内细菌代谢后的终产物,可能具有与植物雌激素相同的作用机制,其生物活性研究主要集中在其雌激素样作用及抗氧化作用。雌马酚对多种疾病具有显著的防治作用,与其前体(三羟异黄酮和二羟异黄酮)相比,雌马酚具有更强的药理和生物活性,对乳腺癌的防治作用也远远优于大豆异黄酮。有研究指出,雌马酚可以直接作用于信号分子和转录因子,使其结构或活性发生改变。因此,作为植物雌激素的代谢产物,雌马酚除了通过雌激素样作用发挥其生物学效应外,可能还具有其他的生物学功能,通过其他途径作用于靶器官,但其作用机制仍然不清楚。自噬(Autophagy),又被称为Ⅱ型程序性死亡,是细胞对于营养不良或外界刺激所产生的一种应激性反应,通过降解自身陈旧性蛋白,功能性细胞器等维持细胞自身代谢所需和细胞器更新的过程。目前自噬与肿瘤的关系受到越来越多的重视。但其作用机制仍不明确。本课题选用雌激素受体表达阴性的人乳腺癌MDA-MB-231细胞为研究对象,观察雌马酚对细胞生长情况的影响,检测雌马酚诱导MDA-MB-231细胞自噬的作用,并进一步探讨其可能的作用机制。研究方法:1.不同浓度雌马酚干预MDA-MB-231细胞48h后,用MTT法测定雌马酚对细胞活力的影响,光学显微镜观察雌马酚对细胞形态的影响,比色法检测培养基中LDH的含量。Comet assay法检测细胞DNA损伤程度。流式细胞术检测细胞死亡情况。2.雌马酚干预MDA-MB-231细胞48h后,透射电镜观察MDA-MB-231细胞内自噬体的形成及数量。免疫细胞化学法及Western Blot法检测自噬标志蛋白Beclin-1的表达。3.雌马酚干预MDA-MB-231细胞48h后,Western Blot法检测MAPK通路蛋白(ERK、JNK和p38)的表达及其磷酸化水平。4.分别以MAPK通路特异性抑制剂预处理MDA-MB-231细胞后进行雌马酚干预,免疫细胞化学和Western Blot法检测Beclin-1蛋白的表达。5.自噬特异性抑制剂预处理MDA-MB-231细胞后进行雌马酚干预,流式细胞术检测细胞凋亡率、免疫细胞化学检测JC-1的表达,TUNEL法检测细胞凋亡,Western Blot法检测凋亡相关蛋白Caspase3,9、Bcl-2、Bax及P53的表达。6. Caspase蛋白特异性抑制剂预处理MDA-MB-231细胞,观察雌马酚作用对beclin-1蛋白表达的影响研究结果:1.雌马酚对MDA-MB-231细胞具有显著的抗增殖作用。与对照组相比,培养基中的LDH浓度显著增加(p<0.05)。2.雌马酚诱导MDA-MB-231细胞自噬。雌马酚作用后,MDA-MB-231细胞内自噬体数量明显增多,随着雌马酚浓度的增加,Beclin-1表达显著增多(p<0.05)。3.雌马酚通过MAPK途径诱导MDA-MB-231细胞自噬。雌马酚作用引起ERK1/2、pERK1/2、c-JNK和pJNK的表达显著增加(p<0.05),抑制ERK1/2及c-JNK后,Beclin-1的表达显著降低(p<0.05);p38和pp38的表达没有显著改变。4.自噬可以诱导细胞凋亡。雌马酚作用后细胞凋亡率显著增高(p<0.05),DNA损伤程度显著增加(p<0.05);抑制自噬后,细胞凋亡率降低(p<0.05),线粒体膜电位显著上升(p<0.05)。凋亡相关蛋白Caspase3,9、p53、Bax的表达显著降低(p<0.05),而Bcl-2的表达显著增加(p<0.05);5. Caspase蛋白家族不同的作用导致不同的结果。抑制Caspase家族活性后,自噬标志蛋白Bcelin-1的表达降低(p<0.05)。结论:1.本实验条件下,雌马酚通过诱导MDA-MB-231细胞自噬而对细胞产生抑制作用;2.雌马酚诱导MDA-MB-231细胞自噬依赖于MAPK信号通路的激活;3. Caspase蛋白家族的作用决定受损细胞导致自噬还是凋亡。