临床胰岛移植最近几年的突破性进展,为糖尿病的治愈带来了希望,其相关的临床和基础研究也进展较快,其中利用转基因技术对胰岛功能进行改造,从而促进胰岛移植的临床应用是一个重要方向。本论文即针对以转基因技术为基础的胰岛生物发光显像技术(BLI),和胰岛被转入外源性胰岛素基因后的合成功能特性,作了一定程度的探讨。BLI可实现对植入胰岛的在体监测,为临床治疗和相关研究提供及时、直接、准确的信息。而将外源性胰岛素基因转入胰岛细胞,可提高其胰岛素合成释放功能,用更少量的胰岛即可达到治疗目的,从而节约供体,在一定程度上缓解供体紧缺的矛盾。此两项技术均可能对促进胰岛移植的广泛临床应用起重要作用。第一部分生物发光显像技术对胰岛移植后植入胰岛监测作用研究【目的】目前的临床胰岛移植对植入受体后的胰岛缺乏安全有效的监测手段,是一个亟待解决的重要问题,本研究通过小鼠动物实验,探讨用BLI监测植入胰岛存活状态的优势,并针对该方法临床应用的主要障碍——光信号因经过厚层组织而发生衰减,无法成像——提出可行的解决方法,即用移植于皮下脂肪内的生物发光胰岛,作为深部器官内植入胰岛的标志,从而证明将BLI用于临床的可行性。【方法】自脑死亡器官捐献者胰腺、及正常B6小鼠、Bclb/c小鼠胰腺分离胰岛,将荧光素酶基因转入胰岛(生物发光胰岛),并制作小鼠糖尿病模型,将生物发光胰岛植入糖尿病小鼠,分别制作皮下脂肪内胰岛移植模型和皮下及肾包膜下同时移植模型。通过选择不同供受体搭配,将模型分为无免疫排斥组和有免疫排斥组。对皮下移植模型,在各设计时间点用生物发光显像装置对受体小鼠进行扫描成像,并测定光密度值,观察无排斥组在不同数量生物发光胰岛移植后,胰岛植入区域的光密度强弱,探讨光密度与植入胰岛数量的相关性;观察有排斥组胰岛植入区域光密度随时间变化的规律,并同期监测受体小鼠随机血糖,比较光密度和随机血糖变化时间。对皮下及肾包膜下同时移植模型,在移植后60d取无排斥组植入胰岛的皮下脂肪和肾脏标本,在移植后7d和10d取有排斥组相同标本,常规组织切片进行HE染色和AF染色,观察组织内植入胰岛的形态、胰岛B细胞功能和胰岛区域炎性反应程度,并将组织学变化时间与光密度及血糖变化时间(皮下移植模型有排斥组)进行对比。【结果】在皮下移植模型中,无排斥组胰岛植入区光密度值与植入胰岛数量呈正相关,有排斥组植入区光密度值在移植后早期升高,随后下降,而随机血糖则先降低后升高,光密度开始下降的时间早于随机血糖开始升高的时间,二者差异具统计学意义。在皮下及肾包膜下同时移植模型中,无排斥组移植后60d不同移植部位的胰岛均形态完整,无炎性细胞浸润,B细胞内含大量分泌颗粒;有排斥组移植后7d可见胰岛植入区域周围呈轻度炎性反应,B细胞内分泌颗粒减少,移植后10d可见植入区域重度炎性反应,胰岛形态破坏及B细胞内分泌颗粒减少。在相同时间点,两个移植部位的组织学变化程度均相同,移植于皮下脂肪内的生物发光胰岛,可以作为深部器官内植入胰岛生存状态的标志。组织学变化时间与光密度和随机血糖变化时间(皮下移植模型有排斥组)相符。【结论】通过转基因技术实现的胰岛BLI,可在活体受体及时、直观、准确的监测植入胰岛存活状态,并可用移植于皮下脂肪内的生物发光胰岛,作为深部器官内植入胰岛的标志,解决BLI应用于临床的障碍。BLI是临床胰岛移植术后监测的良好选择,也为相关研究提供了重要工具。第二部分转入胰岛素基因胰岛的胰岛素合成功能研究【目的】已有研究证明,转入外源性胰岛素基因的人类胰岛,在受高浓度葡萄糖刺激时,可比正常胰岛分泌更多的胰岛素,在胰岛移植模型中,此种转基因胰岛具备更高的逆转糖尿病受体高血糖的能力。本研究通过转基因技术制作具有双胰岛素系统的胰岛模型,并模拟移植后体内损伤因素,从细胞内胰岛素含量的角度,探讨转入胰岛素基因胰岛的合成功能特性,并探讨当损伤因素存在时,其胰岛素合成功能是否比正常胰岛具有更强的抵抗力,从而进一步揭示此种转基因胰岛的生物学特性。【方法】自正常C57/B6(B6)小鼠胰腺分离胰岛,将人类前胰岛素基因转入这些胰岛并表达,制作可表达内源性和外源性两种胰岛素的双胰岛素模型,并在体外随机分组进行正常培养或加入促炎细胞因子培养,在设计时间点取胰岛样品,经超声裂解后分别测定细胞内不同种类胰岛素含量,观察它们在不同培养条件下的变化的规律,并计算各时间点胞内胰岛素总含量,与正常胰岛进行对比。【结果】在正常培养中,正常小鼠胰岛与转基因小鼠胰岛细胞内胰岛素总含量,在培养过程中无统计学差异,并在9d内保持稳定,而转基因胰岛细胞内人类胰岛素含量则随时间逐渐增高;在加入促炎细胞因子的培养中,正常小鼠胰岛与转基因小鼠胰岛细胞内胰岛素总含量,均自加入细胞因子后第5d至6d开始逐渐下降,但在相同时间点无统计学差异,转基因小鼠胰岛细胞内人类胰岛素含量亦有相同变化规律。【结论】以往研究所证明的,转入外源性胰岛素基因胰岛比正常胰岛具有更高的逆转高血糖能力,并非由于其细胞内含有更多的胰岛素,而是因为在高糖刺激时,能够合成释放更多的胰岛素。转基因胰岛的胰岛素合成功能对细胞因子不具有更强的抵抗力,而是与正常胰岛具有相同变化规律。转基因胰岛的研究可能为临床胰岛移植提供节约供体的重要途径。