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禽传染性支气管炎(Avian infectious bronchitis,IB)是由禽传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)引起的一种鸡的急性、高度接触性呼吸道传染病。主要以呼吸困难、气管啰音、张口呼吸、咳嗽、打喷嚏为特征症状。肾病变型死亡率高,危害严重。传染性支气管炎病毒属于冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的Ⅲ型冠状病毒,为单股正链不分节段的RNA病毒。目前已知大部分的冠状病毒主要通过内吞方式入胞,包括SARS-CoV,MERS-CoV等严重威胁人类健康的病毒。研究表明IBV进入BHK细胞主要依赖于内体的酸性环境,但是具体的入胞方式和内吞机制尚不清楚。本研究选择Vero细胞为主要感染平台,DF-1、H1299、Huh7和BHK细胞作为辅助研究平台,采用多种实验方法鉴定IBV在细胞中的入胞和内吞方式,以及胞内运输途径。一、IBV通过网格蛋白依赖型内吞方式进入细胞利用网格蛋白依赖型内吞抑制剂CPZ、小窝蛋白依赖型内吞抑制剂Nystatin和巨胞饮抑制剂Amiloride分别预处理细胞,IBV感染。发现CPZ的处理显著降低了IBV入胞、病毒蛋白表达、子代病毒的释放(p<0.05),而Nystatin和Amiloride的处理对IBV入胞和后续的病毒复制和子代病毒的释放没有明显影响。利用siRNA干扰动力蛋白Dynamin 1和网格蛋白重链CHC的表达,阻止网格蛋白内吞小体的脱落或者形成,IBV的入胞、病毒复制和子代病毒的释放都发生显著下降(p<0.05)。利用过表达Dynamin 1的显性负突变体阻止内吞小体从细胞膜的脱落,发现IBV的入胞、蛋白表达、以及子代病毒的释放都有显著下降(p<0.05)。以上结果表明IBV通过网格蛋白依赖型内吞方式进入细胞。二、IBV通过结合到脂筏进入细胞在IBV感染过程中,用药物MβCD破坏细胞膜上的脂筏,发现在病毒感染前破坏脂筏,显著降低了病毒的入胞、后续的蛋白表达和子代病毒的释放(p<0.05)。在感染前用MβCD破坏脂筏,再补充胆固醇恢复脂筏的形成,发现病毒的入胞和复制得到一定程度的恢复。脂筏分离实验证明病毒颗粒确实结合到了脂筏上。为了直观观察病毒入胞与脂筏的关系,用染料R18标记病毒,感染细胞,再用抗体标记脂筏,免疫荧光观察发现IBV在感染时首先结合到细胞膜表面的脂筏。以上结果表明IBV感染时能结合细胞膜脂筏,且依赖于脂筏入胞。三、IBV入胞过程引起细胞骨架重排用R18标记的IBV感染细胞,鬼笔环肽标记肌动蛋白,免疫荧光观察发现IBV入胞后与肌动蛋白共定位,且从形态学上观察到细胞骨架微丝在感染过程中发生解聚,然后恢复聚合。用肌动蛋白合聚合抑制剂Cyt D和稳定剂Jas处理细胞,发现能明显提高IBV的入胞以及后续的蛋白表达。以上结果表明IBV入胞能够引起细胞骨架重排。四、IBV在细胞内吞小体中的运输和膜融合用R18标记的病毒感染细胞,免疫荧光观察发现,IBV进入细胞后会沿着早期内体、晚期内体,最终到达溶酶体。用R18和DIOC标记的病毒感染细胞,发现IBV在进入晚期内体和溶酶体后发生囊膜与内体膜的融合(在膜融合过程中R18和DIOC信号发生分离),释放基因组到细胞质中。本实验还构建了Rab5和Rab7的野生型质粒、显性负突变体质粒和持续激活突变质粒。Western blot检测发现,过表达Rab5和Rab7显性负突变体质粒,干扰早期内体和晚期内体的成熟,能够显著降低病毒入胞数量和病毒蛋白的表达(p<0.05)。通过干扰Rab5和Rab7的表达,能减少早期内体和晚期内体的形成,同样可以降低病毒的入胞数量和后续的蛋白表达(p<0.05)。以上结果说明,IBV入胞后沿着内体系统运输,在晚期内体和溶酶体中发生膜融合。综上所述,IBV结合到细胞表面的脂筏,利用网格蛋白介导的内吞途径进入细胞,同时引起细胞骨架的重排,然后沿着内体系统运输,在晚期内体和溶酶体发生融合,释放病毒粒子进入胞浆,开启后续的复制过程。以上结果解析了IBV感染细胞的分子机制,为IB的防控以及抗病毒药物的设计提供了靶点。