背景与目的肾癌是泌尿系最为常见的恶性肿瘤之一,大约占成人恶性肿瘤的3%,其发病率仍在不断增高,全世界每年大约有100,000个人死于肾癌。常见病理类型分别有肾透明细胞癌(75%)、乳头状癌(15%)和嫌色细胞癌(5%)。局限性肾癌可以通过手术得到根治,但约30%的患者在术后可出现肿瘤转移。肾癌在诊断时即大约有40%的患者为局部进展期或者晚期,出现转移的患者预后极差,5年生存率低于10%。因对化疗和放射治疗不敏感,目前中晚期肾癌的治疗手段极为有限。近来随着靶向治疗的应用,中晚期肾癌患者的预后有了一定改善,但效果仍然不够理想。缺乏特异性分子标记物用于肾癌早期诊断、筛查以及术后监测和预后判断,寻求更有效的治疗靶点是目前肾癌诊治过程中所面临的难题。本研究采用荧光差异显示双向凝胶电泳(two-dimensional difference gel electrophoresis,2D-DIGE)蛋白质组学方法联合质谱技术筛选并鉴定肾透明细胞癌组织与癌旁正常肾组织差异表达蛋白质,并对感兴趣差异表达蛋白进行验证。探讨肾癌发生发展的分子机制,以期寻找肾癌特异性肿瘤标记物用于肾癌筛查、临床早期诊断及预后判断,为寻找肾癌新的治疗靶点提供依据。第一章肾癌及癌旁正常肾组织荧光差异显示双向凝胶电泳1.目的建立肾癌及癌旁正常肾组织荧光差异显示双向凝胶电泳胶图,分析选取差异表达蛋白质点作为后续质谱鉴定之用。2.材料和方法随机选取临床分期为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期肾透明细胞癌患者各5例,15例肾癌及配对癌旁正常肾组织均来自南方医科大学附属南方医院泌尿外科手术患者。肿瘤标本均经病理证实为肾透明细胞癌,癌旁组织为癌灶周围5cm以外正常肾组织,均经病理证实无癌细胞侵润。15对样品按照分期分为3组,每组共5对样品,采用标本混合法,对每组肿瘤及癌旁组织分别进行等量混合,液氮研磨共得6份蛋白质样品,内标为该6份蛋白样品的等量混合。Cy3、Cy5荧光染料分别随机交叉标记不同组肾癌及癌旁组织,Cy2标记内标。每块胶上样总蛋白为Cy3、Cy5标记的肾癌和癌旁组织及Cy2标记的内标,共3块胶,避光行双向电泳。Typhoon 9410扫描仪扫描胶体,Decyder软件分析胶图。采用配对t检验,两组间蛋白含量之比≥1.5倍,P<0.05为差异表达蛋白点。考马斯蓝染色制作制备胶,切取差异表达蛋白质点。3.结果电泳结束,采用三种不同的波长488 nm (Cy2),532 nm (Cy3),633 nm (Cy5)激光扫描三张胶,共得到9个扫描图谱。Decyder软件分析扫描图谱,从肾癌及癌旁正常肾组织图谱中筛选出35个差异表达蛋白位点,经考马斯蓝染色建立制备胶后找到27个差异蛋白点,作为下一步质谱鉴定蛋白质点。27个差异蛋白点中最大上调比例为7.364,最大下调比例为8.863。4.结论本研究应用2D-DIGE蛋白质组学技术平台,首次成功制备了荧光素标记的肾癌组织与癌旁正常肾组织差异显示双向凝胶图谱；建立了定量比较蛋白质组学技术路线,并掌握了蛋白质组学研究的基本方法。为揭示肾癌发病机制、探索肾癌肿瘤标记物提供新的研究思路。第二章肾癌组织差异表达蛋白点质谱鉴定1.目的对2D-DIGE筛选的差异表达蛋白质点进行质谱鉴定,明确差异表达蛋白质的名称并文献检索差异蛋白质的功能。2.材料和方法在考染制备胶上找到前述27个相应的差异表达蛋白质点,沿染色边缘切下选定的蛋白点。经脱色及胶内胰蛋白酶消化,提取肽混合物。采用MALDI-TOF MS或串联质谱技术对差异蛋白点进行分析,得到肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprinting, PMF),使用Masort检索程序进行检索(http://www.matrixscience.com),数据库选择Swiss-Prot, Mascort软件给出蛋白质得分确认质谱鉴定结果。3.结果1)27个差异蛋白点共成功鉴定出26种蛋白质。其中11个蛋白质在肾癌组织中表达上调,分别为：加帽蛋白G (CAPG)、纤维蛋白原-β(FIBB)、核苷二磷酸激酶A (NDPK-A)、β-防御素107(D107A)、尼克酰胺-N-甲基转移酶(NNMT)、膜联蛋白A4(ANXA4)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、α-烯醇化酶(ENOA)、血清白蛋白(ALBU)、微纤维相关糖蛋白4(MFAP4)、磷酸甘油酸变位酶1(PGAM1)。2)15个蛋白质在肾癌组织中表达下调,分别为：线粒体琥珀酰辅酶A连接酶-β(SUCB1)、甜菜碱-高半胱氨酸S-甲基转移酶2(BHMT2)、甘油-3-磷酸脱氢酶辅酶Ⅰ(GPDA)、酮己糖激酶(KHK)、过氧化物酶-4(PRDX4)、含自水解酶结构域蛋白14B (ABHEB)、钙结合蛋白(CALB1)、线粒体短/支链特异性酰基辅酶A脱氢酶(ACDSB),细胞色素b-cl复合亚基Rieske样蛋白1(UCRIL)、线粒体烯酰辅酶A水合酶(ECHM).谷胱甘肽S-转移酶P(GSTP1)、醛糖1-表异构酶(GALM)、线粒体NADH脱氢酶黄素蛋白2(NDUV2)、Ribosyldihydronicotinami脱氢酶(NQ02)、谷胱甘肽过氧化物酶3(GPX3)。4.结论通过对质谱鉴定出的差异表达蛋白质分析显示,肾癌发生、发展过程中蛋白质水平上的改变非常复杂,这些差异表达蛋白涉及到细胞活动的多个过程和步骤。其中多个蛋白是我们首次筛选出的肾癌差异表达蛋白质。第三章免疫组化方法验证差异表达蛋白质在肾癌中的表达及其临床意义1.目的对2D-DIGE所筛选的差异表达蛋白质进行验证,了解2D-DIGE结果的准确性,并探讨其与肾癌临床病理因素及预后之间的关系。2.材料和方法选取1999年1月至2002年8月期间在南方医科大学南方医院和中山大学肿瘤防治中心经手术治疗的152例肾透明细胞癌组织标本,其中Ⅰ期60(39.5%)例、Ⅱ期37(24.3%)例、Ⅲ期30(19.7%)例及Ⅳ期25(16.4%)例。所有患者术前均未接受放、化疗及免疫治疗。另取40例同期配对癌旁正常肾组织(均经病理证实)作为对照。采用免疫组化SP法,检测PRDX4蛋白和CAPG蛋白在肾癌及癌旁正常肾组织中的表达。采用SPSS 13.0统计软件包进行数据分析。卡方检验用于率的比较分析,Spearman进行相关分析；生存分析采用Kaplan-Merier法,Log-Rank检验比较生存曲线之间的差异；并采用单因素和多因素COX风险比例模型进生存分析,变量包括患者年龄、性别、肿瘤大小、病理分级、T分期、N分期、M分期和CAPG蛋白表达水平。P值<0.05表示差异有统计学意义。3.结果1)本组152例,随访时间4-131个月,中位随访时间89个月。1年、3年、5年总体生存率分别为94.1%、80.1%、67.5%。2) PRDX4蛋白与CAPG蛋白在肾癌及癌旁正常肾组织中主要在细胞浆内表达,细胞内着色成浅黄色到褐色不等。PRDX4蛋白阳性表达率在肾癌组织中(36.8%)显著较癌旁正常肾组织中(87.5%)降低(x2=32.594,P<0.001)；相反,CAPG蛋白的阳性表达率在肾癌组织中(55.3%)显著较癌旁肾组织(7.5%)中增高(x2=29.153,P<0.001)。3) PRDX4蛋白的表达与肾癌远处转移(χ2=3.925,P=0.048)和病理分级(x2=6.802,P=0.033)有关,且与远处转移(R=-0.161,P=0.048)及病理分级(R=-O.211,P=0.009)呈负相关。PRDX4蛋白的表达水平与性别、年龄、T分期、淋巴结转移及复发无关(P>0.05)。4) CAPG蛋白的表达与肾癌的T分期(χ2=10.241,P=0.017)、病理分级(x2=7.081,P=0.029)及淋巴结转移(x2=4.316,P=0.038)有关,且与T分期(R=0.220,P=0.007)和淋巴结转移(R=O.169,P=0.038)呈正相关,而病理分级(R=0.133,P=0.102)未达到统计学差异。肿瘤T分期越高、伴淋巴结转移CAPG蛋白阳性率越高。CAPG蛋白的表达与性别、年龄、远处转移及复发无关(P>0.05)。5)PRDX4蛋白阳性表达组和阴性表达组,两组患者5年生存率分别为75.3%和62.7%,两组之间总生存无显著性差异(P=0.862),说明PRDX4蛋白的表达水平对肾癌患者预后无显著影响。6) CAPG蛋白阳性表达组和阴性表达组,两组患者5年生存率分别为60.6%和75.7%,CAPG蛋白阳性表达患者预后显著较差(P=0.010)。采用COX比例风险回归模型对患者预后进行单因素和多因素生存分析,单因素分析显示肿瘤大小、T分期、N分期、M分期、肿瘤分级和CAPG蛋白表达水平为显著影响患者预后的因素,多因素生存分析显示T分期、N分期、M分期和CAPG蛋白表达水平是影响肾癌预后的独立风险因素。CAPG蛋白高表达患者死亡风险是低表达患者的2.121倍(HR 2.121,95% CI 1.288-3.493,P=0.003)。4.结论免疫组织化学验证结果与2D-DIGE实验结果相吻合,显示2D-DIGE是一种较为可靠的蛋白质组学技术平台。PRDX4蛋白和CAPG蛋白与肿瘤进展有关,在肾癌的发生发展过程中可能起一定作用；CAPG蛋白可能成为肾癌预后判断的有效分子生物学标志物及新的治疗靶点。第四章差异表达蛋白质western blot表达水平分析1.目的在免疫组化验证的基础上,进一步验证2D-DIGE筛选的差异表达蛋白质,分析其在肾癌及癌旁正常肾组织中的改变,探讨肾癌的发病机制。2.材料和方法随机选取45例肾透明细胞癌及配对癌旁正常肾组织标本。组织标本均来自南方医科大学附属南方医院泌尿外科手术患者,癌旁组织为癌灶周围5 cm以外正常肾组织,所有患者术前均未接受放、化疗及靶向治疗。Western blot检测PRDX4、CAPG、MFAP4和GALM四个蛋白的表达,实验结果重复三次。软件分析获得各组条带的灰度值,计算蛋白质相对表达量。采用SPSS13.0软件进行统计分析,两组均数的比较采用t检验,单向方差分析(One-Way ANOVA)用于多个样本均数比较,对有意义因素再进行组间多重比较。按P值<0.05表示差异有统计学意义。3.结果1) PRDX4蛋白(t=12.810,P<0.001)和GALM蛋白(t=13.859,P<0.001)在肾癌组织中的相对表达量显著低于癌旁组织,而CAPG蛋白(t=14.125,P<0.001)和MFAP4蛋白(t=16.950,P<0.001)在肾癌组织中的相对表达量则显著高于癌旁组织。2) PRDX4蛋白的相对表达量在不同病理分级之间有显著差异(F=5.827,P=0.008),多重比较分析发现：高分化组与低分化组PRDX4蛋白表达有显著性差异(P=0.007),低分化组表达显著降低；而高分化组与中分化组(P=0.681)、中分化组与低分化组(P=0.180)表达无显著性差异。从相对量来看分化越差PRDX4蛋白表达越低。3) CAPG蛋白的相对表达量与N分期(t=-2.404,P=0.021)和临床分期(F=5.070,P=0.011)有关,淋巴结转移者较无淋巴结转移者CAPG蛋白显著增高。多重比较分析发现：Ⅰ期与Ⅲ/Ⅳ期相比有显著差异(P=0.003),Ⅲ/Ⅳ期中CAPG蛋白的表达显著增高；而Ⅰ期与Ⅱ期(P=0.094)、Ⅱ期与Ⅲ/Ⅳ期(P=0.112)相比无显著差异。从相对量来看临床分期越高CAPG蛋白的表达水平越高。4) MFAP4蛋白的相对表达量与T分期(F=8.123,P=0.001)和临床分期(F=7.396,P=0.002)有关,从表达量来看,T分期和临床分期越高MFAP4蛋白的表达水平越高；而MFAP4蛋白与性别、年龄、N分期及肿瘤分级无关(P>0.05)。5) GALM蛋白相对表达量与患者性别、年龄、T分期、N分期、肿瘤分级及临床分期均无关(P>0.05)。4.结论Western Blot实验结果与2D-DIGE和免疫组化技术验证的结果基本吻合,表明DIGE技术是一种可靠的蛋白质组学方法。进一步的验证研究显示PRDX4. CAPG、MFAP4蛋白和GALM蛋白在肾癌的发生、发展过程中可能起重要作用。全文小结及研究创新点1.本研究首次采用2D-DIGE定量比较蛋白质组学技术,成功制备了荧光素标记的人肾癌组织与癌旁正常肾组织差异显示凝胶电泳图谱。并且据我们所知,本研究是目前最为系统性的采用2D技术筛查中国人肾癌组织差异表达蛋白的蛋白质组学研究。2.27个差异表达蛋白质点经质谱鉴定,共成功鉴定了26种蛋白质。其功能覆盖细胞活动的多个方面,其中多个蛋白质是我们首次采用蛋白质组学技术成功筛选的肾癌差异表达蛋白质,并发现了1个未知差异蛋白。这些差异表达蛋白的筛选为进一步研究打下基础。3.本研究首次显示PRDX4蛋白的表达水平与肿瘤分化程度和远处转移呈负相关,提示PRDX4蛋白的表达缺失在肾癌的进展过程中起一定作用。4.首次发现CAPG蛋白的表达与肾癌T分期、病理分级和淋巴结转移有关,提示CAPG蛋白在肾癌进展过程中可能起重要作用。并且,CAPG蛋白的表达水平是肾癌患者预后的独立影响因素。本研究显示CAPG蛋白有可能成为肾癌预后判断的有效分子生物学标志物和肾癌治疗的新靶点。5.首次发现MFAP4蛋白的表达与肾癌T分期和临床分期有关,提示MFAP4蛋白在肾癌进展过程中可能起一定作用。然而,GALM蛋白的表达与患者性别、年龄、T分期、N分期、肿瘤分级及临床分期无关。