目前扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy, DCM)终末期心力衰竭的治疗尚无行之有效的治疗方法。大量的动物实验和临床试验证实骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem cells, MSCs)能分化成心肌样细胞,为扩心病心力衰竭的治疗提供了新思路。然而MSCs的低分化率、低存活率阻碍和影响了MSCs移植在临床的应用。研究表明环磷酸腺苷(cAMP)对细胞的生长、分化有影响,在不同的细胞发挥不同的作用。cAMP调节细胞的分化主要是通过cAMP/PKA信号传导通路来发挥作用。研究发现cAMP/PKA信号传导通路与参与心肌细胞分化的转录因子GATA-4和参与心肌细胞间缝隙连接形成、传递信息的连接蛋白43 (Connexin43, Cx43)的激活有密切关系。环磷酸腺苷葡胺(Meglumine Cycle Adenylate Phosphate, MCA)作为正性肌力药物用于心力衰竭的治疗。MCA是cAMP类似物,具有cAMP相同的作用。那么MCA对MSCs的生长起促进作用还是抑制作用?MCA能否诱导MSCs分化为心肌样细胞?MSCs和MCA二者联合治疗扩心病心力衰竭的疗效?MCA是否通过cAMP/PKA信号传导通路发挥诱导分化的作用?本实验拟对此进行研究,旨在寻找一种既可以提高移植MSCs存活率和分化率,有效改善心功能,又不会对机体产生不利影响的药物,为MSCs (?)临床治疗DCM心力衰竭提供理论依据。目的：本研究将从体外和体内实验明确MCA对MSCs生长的影响；MCA诱导MSCs向心肌细胞分化的作用,以及二者联合治疗扩心病心力衰竭的疗效及机制。给予PKA抑制剂H89观察心肌特异性基因和蛋白的表达有何变化,探讨MCA经cAMP/PKA信号传导通路发挥诱导分化的作用机制。方法：实验共分五部分：第一部分：骨髓间充质干细胞的培养、鉴定、标记及分化采用全骨髓贴壁培养法培养MSCs,利用MTT法测定细胞生长曲线；流式细胞术鉴定细胞表面抗原CD71、CD45和CD44的表达情况；测定BrdU和DAPI的标记率；给予10μM的5-氮胞苷(5-Aza)诱导24h,培养2w、3w、4w,提取细胞总RNA,利用RT-PCR技术测定心肌特异性基因β-MHCmRNA的表达情况。第二部分：环磷酸腺苷葡胺诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究(1)MTT法测定MCA对MSCs增殖的影响。(2)以5-Aza为阳性对照,通过荧光定量RT-PCR技术比较各浓度MCA诱导MSCs表达心肌特异性基因GATA-4、β-MHC、Cx43 mRNA的情况,确定最佳诱导浓度。(3)在最佳诱导浓度的基础上,给予不同的诱导时间和培养时间,比较分析得出最佳的时效关系。(4)利用荧光定量RT-PCR和流式细胞仪技术比较MCA、MCA联合5-Aza及5-Aza的诱导分化作用。(5)利用Western Blot、免疫细胞化学染色和电镜技术进一步鉴定MCA诱导MSCs向心肌样细胞分化。第三部分：骨髓间充质干细胞移植联合环磷酸腺苷葡胺治疗阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠的疗效观察及机制研究采用阿霉素腹腔注射方法建立阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠模型,随机分为正常组、HF组、MSC组、MCA组、MSC+MCA组和诱导MSC组,观察4周。(1)疗效观察：ELISA法测定治疗前后血清脑利钠肽(BNP)水平；超声心动图测定治疗前后左室收缩末期内径(LVSD)、左室舒张末期内径(LVDD)、左室射血分数(LVEF)及左室短轴缩短率(LVFS)。多导生理记录仪记录左室收缩压(LVSP)、左室舒张压(LVDP)、左室压力上升及下降最大变化速率(±dp/dtmax)等血流动力学参数。测定全心质量指数(HW/BW)及左室质量指数(LW/BW)。心脏标本行HE、Masson染色观察病理结构变化情况。第四部分：骨髓间充质干细胞移植联合环磷酸腺苷葡胺治疗阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠的机制研究采用阿霉素腹腔注射方法建立阿霉素性心肌病心力衰竭大鼠模型,随机分为正常组、HF组、MSC组、MCA组、MSC+MCA组和诱导MSC组,治疗4周后留取心脏组织：免疫组织化学染色和荧光染色方法鉴定各组MSCs移植后在心肌组织的存活和分化情况。Westren Blot技术测定各组心肌转录因子GATA-4和心肌特异性蛋白Cx43、cTNI的表达情况。ELISA测定给予MCA后心肌组织内cAMP水平。第五部分：环磷酸腺苷葡胺诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的机制研究取第3-6代MSCs,随机分为MCA组、H89+MCA组、MCA+5-Aza组、H89+MCA+5-Aza组和空白组。ELISA测定给予MCA后MSCs内cAMP水平。MTT法测定给予PKA抑制剂H89后MCA对MSCs抑制作用的改变；利用荧光定量RT-PCR和Western Blot技术测定给予H89后各组心肌特异性基因和蛋白GATA-4、Cx43、β-MHC的表达变化情况,探讨可能的机制。结果：1、MSCs为长梭形细胞,贴壁生长,生长曲线呈S型。第2、4、6代细胞增殖能力接近。BrdU标记率为94%,DAPI标记率达100%。细胞表面标志抗原CD44和CD71呈阳性表达,不表达CD45。经5-Aza诱导后MSCs表达心肌特异性基因β-MHCmRNA。2、(1)MCA抑制MSCs细胞增殖,表现为时间和剂量依赖性,其中10-2M对细胞增殖的抑制作用尤为显著。(2) GATA-4、β-MHC、Cx43mRNA在10-2M、10-3M、10-4M、10-5M的MCA组均有表达,其中GATA-4、β-MHCmRNA在10—3M组表达最多(P<0.05)；Cx43mRNA在10—SM组表达最多,其次在10—3M组。(3)给予10-3M的MCA分别诱导1d、3d、5d、7d、9d, GATA-4、β-MHC、Cx43mRNA都有所表达；各诱导时间下随着培养时间的延长GATA-4、β-MHC、Cx43mRNA表达量逐渐增多,至第4周在10-3M诱导3d组表达量最高(P<0.05)。(4) GATA-4、β-MHC、Cx43mRNA基因在MCA组的表达量高于5-Aza组；而MCA联合5-Aza后的基因表达量较MCA组和5-Aza组则显著升高(P<0.05)。流式细胞术测定MCA组诱导分化率略高于5-Aza组,而MCA+5-Aza组的诱导分化则明显高于MCA组、5-Aza组(P<0.05)。(5)WB可见cTNI位于23kD附近有特异性条带,其中MCA组、MCA+5-Aza组、5-Aza组,与空白组相比表达明显增加；MCA联合5-Aza组则较MCA组、5-Aza组表达增多(P<0.05)。免疫细胞化学染色可见诱导4周后部分细胞胞浆内出现棕褐色免疫复合物,心肌特异性蛋白a-actin、desmin、cTNI、Cx43染色呈阳性反应。电镜观察MCA组、5-Aza组和MCA联合5-Aza组的细胞超微结构,可见有微肌丝、线粒体、核糖体和发达的高尔基体等细胞器聚集在核周围,符合心肌细胞超微结构。MCA联合5-Aza组的肌丝排列较MCA组、5-Aza组整齐,且数量多,细胞器数量也较多。3、(1)BNP变化：各治疗组经过治疗BNP有所下降,与治疗前相比(P<0.05)；其中MSC+MCA组、MSC组、诱导MSC组较MCA组相比下降明显(P<0.05)。(2)超声心动图：各治疗组治疗后LVSD、LVDD与治疗前相比有下降且有统计学意义(P<0.05),与HF组相比有所改善(P<0.05)；其中MSC+MCA组与MSC组、诱导MSC组相比P>0.05,但见到MSC+MCA组下降幅度较大。各治疗组治疗后LVEF、LVFS与治疗前相比有所升高(P<0.05)；其中治疗后LVEF、LVFS在MSC组、MSC+MCA组与MCA组、诱导MSC组相比升高改变明显(P＜0.05); MSC+MCA组与MSC组相比改变显著(P<0.05)。(3)血流动力学结果：治疗后LVSP、±dp/dtmax在MSC组、MSC+MCA组、MCA组和诱导MSC均有所升高,LVDP有所降低；其中MSC+MCA组与其他各治疗组比较改变明显(P<0.05)。(4) HW/BW、LW/BW在MSC组、MSC+MCA组、诱导MSC组有所降低(P<0.05)。HE染色可见HF组心肌组织呈心肌病样改变,各治疗组可见心肌细胞变性程度减轻。其中MSC组、MSC+MCA组、诱导MSC组可见变形程度减轻,并有毛细血管形成。Masson染色可见HF组满视野蓝色纤维,各治疗组都还有纤维化存在,但较HF组有所减轻。4、(1)免疫组化染色在3个MSCs移植组有散在分布的BrdU阳性细胞。MSC+MCA组的阳性细胞数多于MSC组和诱导MSC组(P<0.05)。(2)免疫组化双标可见3个MSCs移植组均有散在分布的、细胞核为棕黄色,胞质中有棕黄色肌原纤维结构的移植细胞。(3)心肌组织cAMP含量,在MSC+MCA组、MCA组明显高于MSC组和HF组(P<0.05)。(4)WB结果：MSC组、MSC+MCA组和诱导MSC组与HF组相比GATA-4、Cx43、cTNI表达明显增加(P<0.05); MSC+MCA组的GATA-4、Cx43、cTNI的蛋白表达量较MSC组和诱导MSCs组明显增多。5、(1)给予不同浓度MCA、不同作用时间点MSCs细胞内cAMP含量明显升高,且随着药物浓度的升高细胞内浓度也升高。(2)H89干预后能减轻MCA对细胞增殖的抑制作用。(3)荧光定量RT-PCR结果：MCA组和MCA+5-Aza组诱导MSCs表达GATA-4、MHC、Cx43mRNA;给予H89干预后,GATA-4、MHC、Cx43mRNA的表达量显著减少(4)WB结果：MCA诱导后MSCs的GATA-4、Cx43、cTNI的表达量显著增加(P<0.01)；给予H89后,GATA-4、Cx43、cTNI的蛋白表达量明显减少(P<0.05)。结论：1、采用全骨髓贴壁培养法成功分离、培养了MSCs,通过观察细胞生物学特性、流式细胞仪测定细胞表面抗原结果符合MSCs标准,证实该培养方法得到细胞为MSCs,且具有向心肌样细胞分化的能力,同时BrdU、DAPI标记MSCs的标记率高。全骨髓贴壁培养法培养的细胞可用于MSCs的实验研究。2、MCA抑制MSCs的增殖,诱导MSCs向心肌细胞分化。最佳诱导浓度为10-3M,最佳诱导时间为3天。MCA诱导分化作用略强于5-Aza,其同5-Aza联合能发挥协同作用。3、MCA不仅可以用于治疗心力衰竭,还可以与MSCs联合发挥协同作用,改善心脏病理改变,缓解心功能。4、在体给予MCA后,心肌组织内cAMP水平升高,促使MSCs表达GATA-4、Cx43增加,诱导MSCs向心肌细胞分化,提高移植细胞的存活率和分化率。5、给予MCA后,升高细胞内cAMP水平,促进GATA-4基因的表达,促进MSCs向心肌细胞分化,使心肌特异性蛋白表达增加；还可上调Cx43基因的表达,进一步促使MSCs向心肌样细胞分化。给予PKA抑制剂H89后,这些基因和蛋白表达减少,H89可以抑制MCA诱导分化的作用,因此MCA主要通过cAMP/PKA信号通路发挥诱导作用。