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目的 Wn信号传导途径与肿瘤有着密切的关系，其通路的异常活化参与人类多种癌症的发病过程，因此，抑制或阻断Wnt通路的异常活化有望成为抗肿瘤治疗的新靶点。尽管目前已发现由细胞内分泌的内源性Wnt通路抑制剂能够拮抗Wnt通路，如FrpHE(frizzled-related protein)、DKK-1(Dickkopf-1)等，但有关这些内源性Wnt通路抑制剂的调控机理尚不清楚。本课题的目的在于研究外源性因素对Wnt通路抑制剂FrpHE和DKK-1的诱导表达，我们选择抗癌药物p53及化疗药阿霉素、羟喜树碱、顺铂作为外源性诱导剂，以期弄清Wnt通路及其抑制剂FrpHE和DKK-1是否能够被p53和化疗药这两类药物所调节。 方法 将外源性p53基因导入到p53缺失的人肝癌细胞株(Hep3B)中，通过流式细胞术和RT-PCR观察p53对Wnt通路及抑制剂FrpHE和DKK-1的作用。利用反义寡核苷酸(oligodeoxy nucleotide，ODN)将p53反义ODN导入到人肝癌HepG2(含野生型p53)和人大肠癌Lovo(含野生型p53)细胞株中，观察p53表达受阻后对Wnt通路及FrpHE、DKK-1表达的影响，以进一步明确p53的调节作用。并且在不同p53状态的人肝癌、大肠癌、神经胶质瘤细胞株中(U251,p53突变)加入化疗药物后，以RT-PCR技术检测Wnt通路抑制剂FrpHE mRNA和DKK-1 mRNA的表达水平，明确化疗药对Wnt通路抑制剂FrpHE和DKK-1的调节作用。 结果 1．将转染剂量为5pfu／cell时应用流式细胞术观察Adp53的转基因情况，结果表明Adp53转染24h、48h后96％以上的第一军医大学博士研究生学位论灰细胞p53表达呈阳性，平均荧光量增加了约50倍，表明p53基因转染成功。 2.盯一PeR检测结果(l)p53对F印HE、DKK一1的 表达具有诱导作用:通过加入外源性p53检测结果显示:FrpHE 和DKK一1在人肝癌阴性细胞株(HeP3B，p53缺失)中转染Adp53 后16h、20h、24h、28h、32h、36h、4Oh时，InRNA表达水平20h 起明显增加，32h最高，36h、40h时逐渐回落，但仍高于对照组 水平。FrpHE和DKK一1在人肝癌阴性细胞株转染Adp53剂量为 0 .ospfu/eell，0.spfu/eell，spfu/eell，50pfu/eell时，F印HE mRNA表达水平在转染剂量为SPfu/cen时最强，在SOPfu/cen 时逐渐回落，但仍高于对照水平;DKK一lmRNA表达水平在转染剂 量为0.05pfu/eell时明显增加，在50pfu/eell时最强。 (2)阻断肿瘤细胞内正常p53的表达，可引起抑制剂FrPHE、 DKK一l表达的下调:通过加入反以寡核昔酸检测结果显示:FrpHE mRNA表达水平在人肝癌p53阳性细胞株(HePG2)中24h时表达水 平降低，48h和72h时呈现显著的抑制作用，在人大肠癌p53阳 性细胞株(Lovo)中未有表达;DKK一lmRNA表达水平在人肝 癌p53阳性细胞株(HePG2)和大肠癌p53阳性细胞株中24h时表 达水平降低，48h和72h呈现显著的抑制作用; (3)化疗药对抑制剂FrpHE、DKK一1的表达具有上调作用， 加入化疗药(经喜树碱、阿霉素、顺铂)结果显示:FrpHE mRNA 表达水平在人肝癌细胞株(HePGZ，HeP3B)中与对照组相比表达 水平增加，在人大肠癌和神经胶质瘤细胞中没有表达;DKK一 lmRNA表达水平在人肝癌(HePGZ，HeP3B，)、大肠癌细胞、神 经胶质瘤细胞株中与对照组相比表达水平增加;第一军医大学博士研究健李位伦失 3.p53对Wnt通路关键因子p一catenin具有明显抑制作用，流式细胞术检测结果显示:转染Adp53后，在肝癌 (Hep3B)细胞中Wnt通路关键靶基因p一catenin蛋白的表达水平下降;加入p53反义。DN抑制p53表达后，在肝癌(HePG2)和大肠癌(Lovo)细胞中p53基因的表达水平明显下降，p一catenin蛋白的表达升高;加入化疗药后，在不同的肿瘤细胞中，p一catenin蛋白的表达下降;结论抑癌基因p53和化疗药经喜树碱、顺铂、阿霉素能够诱导Wnt通路抑制剂FrPHE和DKK一的表达，进而产生抑制Wnt通路的作用。抑制剂FrpHE在人大肠癌株(Lovo)和神经胶质瘤细胞株(u251)种没有表达。证明FrpHE在某些肿瘤细胞中存在缺失现象。