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目的：
研究阴道毛滴虫体外培养中铁离子对其生长的影响,阴道毛滴虫在-78℃低温保存的适宜条件,及体外连续培养中阴道毛滴虫Tvmar1基因的遗传稳定性。
方法：
1.在TYM(trypticase-yeast extract-maltose)培养基(pH6.0)中,加入100～400μmol/L的铁离子,并设不添加铁离子组为对照,调节阴道毛滴虫初始浓度为l×105/ml,于37℃定量培养。采用台盼蓝染色法镜下观察并计数活滴虫数及死滴虫数,绘制生长曲线及存活率曲线,并计算世代时间。通过连续稀释的方法测定在添加200μmol/L铁离子的TYM培养基和不添加铁离子的对照TYM培养基中甲硝唑对阴道毛滴虫的最小致死浓度(minimal lethal concentration,MLC)。
2.在-78℃,观察5％～20％二甲亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)和甘油、滴虫密度(3×105～1×107)/ml及冻存时间(1～16周)对阴道毛滴虫低温保存效果的影响。采用缓慢冻存和快速复苏。复苏后用台盼蓝染色法检测阴道毛滴虫的存活率,并用TYM培养液重悬后于37℃培养,观察其生长繁殖状况。
3.分别用阴道毛滴虫Tvmar1基因的2条单一特异性引物,应用MGE-PCR方法扩增4例人型支原体阴性的阴道毛滴虫临床分离株培养5、10、15和20代Tvmar1的长度和位置,分析其长度扩增的特异性及稳定性,并根据其位置图谱构建系统进化树分析其遗传稳定性。
结果：
1.在加入100、200、300和400μmol/L铁离子的培养基中,阴道毛滴虫均于40 h达最高密度,分别为2.9、3.2、3.1和2.8×106/ml,对照组阴道毛滴虫于54 h达最高密度,为2.5×106/ml。400μmol/L铁离子组阴道毛滴虫的世代时间为(6.8±0.7)h,较100～300μmol/L铁离子组的世代时间[(4.8±0.3)、(4.8±0.2)和(5.0±0.4)h]延长(P<0.05),而100～400μmol/L铁离子组的世代时间均短于对照组[(10.2±3.1)h](P<0.05)。含200μmol/L铁离子组阴道毛滴虫的甲硝唑最小致死浓度为(23.44±11.56)μg/ml,明显低于对照组中的甲硝唑最小致死浓度[(31.25±15.44)μgml](P<0.05)。
2.阴道毛滴虫适宜的冻存密度为(1～2)×106/ml,甘油和二甲亚砜均可用做冷冻保护剂,10％甘油(平衡4小时)和10％DMSO(不需平衡时间)的保护效果最好(P<0.05),复苏存活率分别为38.0％和31.7％,两者的保存效果无明显差异(P>0.05),且短期冻存(1～16周)的效果良好,均可在37℃重悬培养至对数生长期。
3.阴道毛滴虫临床分离株体外培养的5、10、15和20代,均扩增出一条1304 bp的特异性条带,根据Tvmar1基因位置MGE-PCR图谱绘制的系统进化树表明其5～20代的遗传关系较近,均在同一分支。
结论：
1.阴道毛滴虫在加入100～400μmol/L铁离子的TYM培养基中均比普通TYM培养基中生长较快,甲硝唑对阴道毛滴虫的最小致死浓度也较低。阴道毛滴虫体外培养20代,Tvmar1基因的长度和位置均较稳定。
2.在-78℃用10％甘油冻存阴道毛滴虫效果较好。