第一部分先天性巨结肠RET基因和PHOX2B基因多态性研究研究背景先天性巨结肠(Hirschsprung’s disease，HD)，是小儿外科常见疾病，在高加索人，非洲黑人、亚洲黄种人的发病率分别为万分之1.5、2.1、2.8，亚洲人种发病率最高。HD是一种神经嵴源性疾病，当胚胎发育过程中神经嵴细胞迁徙、分化发生停顿或发生细胞凋亡，均会导致远端肠管的神经支配异常而导致HD。近年来通过遗传连锁分析和基因敲除等技术，发现有以下基因的突变与HD的发病有关：编码有关酪氨酸激酶通路基因(包括RET原癌基因，GDNF基因，GFRα-1基因等)，编码血管内皮素信号通路的基因(包括EDNRB基因，EDN3基因和ECE-1基因)，编码转录因子的基因(如SOX10基因和PHOX2B基因)等。其中RET基因表达对肠神经元细胞的发育十分关键，在HD的发病中最为重要。但对HD进行大量RET基因突变研究发现，仅有20％左右的散发性和50％左右家族性HD存在突变，而且缺乏类似肿瘤相关的热点突变，另外HD相关RET突变有不完全外显(incomplete penetrance)，呈突变效应性别相关性。更为重要的是，在家族性病例，遗传连锁分析定位遗传位点在10q11.2，却仍缺乏RET编码区突变。随着SNPs疾病相关性研究的进展，对HD的RET基因研究重点逐渐转移到多态性的研究上。尚未证实单个SNPs导致HD相关RET功能改变，但可能有精确的SNPs组合(单倍型)决定调节意义。在高加索人种，发现有数个RET编码区SNPs与散发性HD相关：A45A(c135G＞(?)；exon 2)和L769L(c2307T＞(?)；exon 13)。对RET基因启动子的研究发现，在RET编码序列上游的启动子的两种多态性-5G＞A和-A＞C与HD相关。目前对RET基因的研究，均局限于编码区的突变及SNPs研究，虽然也有少量非编码区(内含子和启动子)的研究，但缺乏相应的功能研究。PHOX2B基因表达研究证明，PHOX2B编码的同源域蛋白与多种非肾上腺素能神经元的发育有关，因此推断PHOX2B基因的改变可能与自主神经发育异常性疾病相关。在小鼠胚胎学研究发现，一旦成肠细胞进入到前肠间叶，即有PHOX2B蛋白表达，并贯穿肠神经元发育的始终。PHOX2B基因突变纯合子小鼠全胃肠道缺乏神经元，与HD病变相似，同时，该突变的小鼠无RET蛋白表达，因此推测PHOX2B基因可能与HD有关。Garcia-Barcelo通过对91例单纯HD研究，发现PHOX2B 1364 A＞G多态性与HD有关。目前对PHOX2B基因与临床疾病的关系研究尚处在起步阶段，PHOX2B基因与HD的研究也仅有个别报道，PHOX2B基因是否参与HD的发病机制仍有待进一步的研究。根据Hapmap组织统计数据，不同种族人群的SNPs分布频率有明显差异，RET基因和PHOX2B基因SNPs也是如此，这可能是不同种族人群HD发病率有明显差别的原因之一。本课题拟通过对浙江汉族人群HD患者和正常人群的对照研究，分析RET基因和PHOX2B基因SNPs与HD发病之间的关系，不同类型HD与基因SNPs关系，进一步推断主要的HD相关单倍型，并对照其他种族人群已有数据，分析浙江汉族人群的SNPs分布特点。同时应用免疫组化法，检测RET基因启动子多态性与RET蛋白表达之间的关系。材料和方法1．病例收集及标准(1)病例组：全部病例均为本院的浙江籍先天性巨结肠患儿，共123例。根据2005年第四届国际巨结肠与相关神经嵴源性疾病会议的巨结肠诊断标准，重新阅片确定。(2)分组及标准：将巨结肠分为短段型与长段型两种。短段型HD：病变仅局限于乙状结肠远端，乙状结肠直肠交界及直肠。长段型HD：病变范围包括乙状结肠近端，升结肠及累及范围更广者。(3)正常对照组：全部正常对照组均来自本院正常体检小儿，排除消化道和神经嵴相关畸形，共194例。全部病例及对照组抽取外周血2ml，3.8％枸橼酸钠抗凝。本研究经浙江大学医学院附属儿童医院伦理委员会批准，全部患儿及对照组均获得家长知情同意。2．PCR反应及测序对全部样本进行DNA提取后，根据选取的SNPs，合成引物，PCR扩增，经2％琼脂糖电泳证实PCR产物后，将PCR产物进一步纯化、测序。3．免疫组化根据RET启动子多态性，分别选取相应患儿病理组织切片，观察神经元，确定含正常神经元蜡块，再行C-Ret免疫组化染色，将该切片镜下所有神经元按免疫组化反应等级均予计数。4．统计方法(1)用Hardy-Weinberg平衡定律来检验样本人群中基因频率与基因型频率是否平衡。(2)基因和疾病的相关性分析：使用x2方检验(Chi squared)，相关性以比值比(odds ratios，ORs)及其95％可信区间(confidence intervals，CIs)表示，以P值＜0.05确定为统计学差异有显著性。(3)单倍型频率用PHASE软件计算。(4)免疫组化结果用非参数统计中的两样本等级和检验(Mann-Whitney Test)。结果1．各位点基因型与HD风险RET基因-5G＞A，-1A＞C，c135G＞A，c2307T＞G四个位点的少见基因型AA，CC，AA，GG在HD组频率明显高于对照组(P＜0.05)。PHOX2B基因1364A＞G两组间未发现有基因型差异。2．各位点等位基因频率与HD风险RET基因-5A，-1C，c135A，c2307G在HD组等位基因频率明显高于对照组(P＜0.05)。PHOX2B基因1364A＞G等位基因分布未发现显著性事件。3．各位点等位基因频率与HD类型关系RET基因各位点均未发现等位基因频率在不同类型间的差异。4．单倍型与HDRET基因启动子单倍型-5A／-1C占HD组82.5％，较对照组差异有显著性(P＜0.05)。RET基因四位点(-5，-1，c135，c2307)单倍型ACAG占HD组75.2％，较对照组差异有显著性(P＜0.05)。5．不同种族人群之间各等位基因频率RET基因-5A、c135A和c2307G等位基因频率明显高于高加索和非洲人种(P＜0.05)6．RET基因启动子多态性与RET蛋白表达关系RET基因启动子基因型-5AA／-1CC较其他基因型RET蛋白表达降低(P＜0.05)。启动子单倍型-5A／-1C纯合子较-5A／-1C杂和子RET蛋白表达降低(P＜0.05)。结论1．RET基因-5G＞A，-1A＞C，c135G＞A，c2307T＞G四个位点多态性与浙江汉族人群HD明显相关，但与HD类型无明显相关。2．RET基因-5G＞A，-1A＞C，c135G＞A，c2307T＞G四个位点单倍型ACAG是浙江汉族人群的HD相关核心单倍型。3．浙江汉族人群的RET基因-5、c135和c2307位点的少见等位基因频率较其他人种有明显增高。4．RET启动子多态性对启动子功能有影响，与RET蛋白表达相关。5．未发现PHOX2B基因多态性与浙江汉族人群HD相关。第二部分肠神经元发育不良病理特点及与EC关系研究研究背景近年来逐渐认识到一类临床表现与HD十分相似，但病理改变与HD明显不同的疾病，称之为巨结肠同源病(allied disorders of Hirschsprung’s disease；ADHD)，主要包括肠神经元发育不良(Intestinal neuronal dysplasia；IND)、神经节细胞减少症(Hypoganglionosis)、神经节细胞未成熟症(Immaturity of ganglion cells)等。1994年Holschneider和Meier-Ruge将HD和ADHD两者统称为肠神经元异常(Neuronal intestinal malformations；NIM)，并进行了详细的病理分类。在ADHD中以IND最为常见，其病理特点主要有以下4项：①粘膜下和肌间神经丛增生，形成巨大神经节(giant ganglia)，粘膜下丛节细胞数目≥7个(正常为3～5个)，肌间丛面积≥正常的3倍，常伴有神经元不成熟现象；②粘膜固有层和环肌副交感神经纤维乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，Ache)活性增高：③粘膜固有层和粘膜肌层分散的平滑肌纤维之间有孤立的神经节细胞；④肌间神经丛交感神经发育不全或无发育。混合型IND的临床表现几乎与HD一样，单纯型IND的发病主要集中在年幼儿童，而在新生儿期较少表现。临床表现为渐进性的便秘，腹胀或有顽固性／发作性的吸收异常。部分患儿经保守治疗或随年龄增长能逐渐好转，部分患儿则呈进行性加重，需手术治疗。针对HD的辅助检查中，包括钡剂灌肠、直肠肛管测压，IND常缺乏特征性的改变而无法准确应用。目前国内对1ND的认识仍不足，一般根据临床表现或结合钡剂灌肠检查就予诊断并进一步手术治疗，随着经肛门手术的广泛开展和手术年龄提前至新生儿和婴幼儿期，单凭临床表现和钡灌肠可误将部分单纯型IND诊断为HD而手术治疗。虽然IND作为一种明确的病理改变已经得到广泛认同，对IND是否作为一种独立的疾病一直存在争议，分歧的焦点在于IND是一种原发性疾病还是继发性改变，两者都有相应的证据支持。IND的诊断标准仍存在争议，Meier-Ruge提出了改良的粘膜活检来诊断IND，但行多处肠壁的全层病检，HE染色或Ache染色，对神经元发育不良较难判断的，加行神经元相关免疫组化检测的方法较为公认。对IND的手术指征和切除标准仍不确定，大部分的单纯型IND可以根据病情适当的保守治疗(如改变饮食结构，应用缓泻剂等)和临床观察，随生长发育部分患儿不手术也可以自行好转甚至自愈，在一定条件下(如肠造瘘)，IND病变可以自行再发育为成熟的神经元细胞而恢复功能。但对严重腹胀，小肠结肠炎患儿仍需及时手术治疗，局限型IND，可以将病变肠段全部切除，以达到较好的手术效果；而对广泛性病变，仍缺乏切除范围的明确标准，可先行回肠造瘘术，营养情况改善后再行进一步根治术，有报道切除小部分病变结肠到全部结肠(甚至部分小肠)。临床常见部分患儿巨结肠术后恢复良好，而部分患儿术后一段时间内仍有反复EC，甚至需要再次肠造瘘。术后EC是否与伴发IND病变有关?本课题拟通过对IND与HD的临床和病理资料的统计，研究术后EC和神经元形态、分布的关系。虽然对IND的光镜下病理特点有较多报道，但发育不良神经元的超微结构特点仍缺乏研究，这也是本课题的研究目的。同时，并通过对IND的NSE、Cathepsin-D和S-100的免疫组化染色，分析对IND的镜下免疫组化特点和有效的诊断手段。材料和方法1．IND的神经元分布与EC特点(1)研究对象及临床资料收集：收集2001年～2004年本院诊断的巨结肠手术治疗的患儿，共347例。进行随访(≥6月)，评价患儿术后排便，腹胀情况，术后EC发生情况(以随访时间≥6月，发生≥2次EC为反复EC)；是否有再次手术。(2)组织切片阅片、分类：根据患儿的病理号，调取所有患儿病理切片，每个病理号一般有4～6张切片，分别标记为A、B、C、D、E、F等，对应取材部位从大体标本痉挛段—移行段—扩张段—切缘，其中首尾编号分别对应痉挛段和切缘。重新阅片后，参照Holschneider提出的有关神经元异常的病理诊断标准进行分类。2．免疫组化染色根据组织切片结果，调取20例IND病变组织蜡块，同时取5例HD患儿神经元正常肠段组织和2例美克尔憩室肠切除边缘组织，分别进行NSE、Cathepsin-D和S-100免疫组化检测。3．透射电镜检查(1)研究对象及取材：巨结肠术中切除肠段立即取材，切取小块肠壁组织，在2.5％戊二醛液体覆盖下，进一步切割组织尽可能小，估计保留肌间组织和两侧部分肌层。样本置2.5％戊二醛4℃保存，根据病理结果，将所需样本分类：神经元正常肠段和IND病变肠段。(2)戊二醛—锇酸双重固定，脱水，浸透，包埋，固化，预切片定位，超薄切片，电镜观察、拍片、记录。4．数据处理统计所有HD、IND和HD／IND病变患儿临床资料，病理结果，采用x~2检验行统计学分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。结果1．IND的神经元分布与EC特点(1)临床随访结果：获有效随访(≥6月)324例。根据组织类型，对其中HD210例，IND38例，HD伴IND(HD／IND)45例共293例患儿作为本课题研究对象。术后反复EC共41例，再次手术8例。(2)病理观察结果：IND和HD／IND的异常神经元分布与典型HD不同，在扩张段和切缘都有较高比例的异常神经元分布(P＜0.01)。(3)IND与EC关系：IND和IND／HD组的术后反复EC发生率高于典型HD组(P＜0.01)。切缘IND病变组术后反复EC发生率明显高于切缘神经元正常组(P＜0.01)。经肛门手术与经腹手术的术后反复EC发生率分别为18.1％和8.7％(P＜0.05)。(4)再次手术与病理类型：有8例患儿术后因仍有反复腹胀、便秘或严重的EC再次行手术治疗，5例为切缘有IND(其中4例HD／IND，1例IND)，有3例为HD第一次术后切缘仍无神经元细胞。2．IND的免疫组化特点NSE免疫组化结果：粘膜下神经丛和肌间神经丛均有显色，神经丛胶质细胞、神经元细胞和神经纤维均呈阳性反应。IND病变肠段粘膜下及肌间均有巨神经丛，丛内各成分细胞均呈阳性反应，神经丛内有大量大小不等细胞，为胶质细胞与发育不良神经元，其中可见部分细胞胞体较大。Cathepsin-D免疫组化结果：神经丛内仅神经元细胞胞浆呈阳性反应，神经纤维和胶质细胞均呈阴性反应。IND病变可见巨神经丛内有大量神经元细胞，形态较正常小，胞浆少，染色较深，细胞核较正常小，染色深，核仁有或不明显。S-100免疫组化结果：神经丛内神经纤维和胶质细胞呈阳性反应，神经元细胞反应呈阴性。IND病变可见巨神经丛内布满大小不一的缺损区，缺损区中央可见发育不良细胞核，神经纤维增生不明显。3．IND透射电镜下特点正常神经元细胞直径约20～30gm，细胞形态较不规则，胞浆丰富，胞浆内可见清晰的线粒体、光面内质网和粗面内质网，伴有大量的神经内分泌囊泡结构，囊泡内可见递质颗粒。细胞核直径约7～8μm，细胞核较为规则，核膜完整。核仁明显，核内染色质疏松，分布均匀。IND病变神经元细胞直径约10～15μm，细胞形态较为规则，胞浆较正常神经元明显减少，胞浆内可见清晰的线粒体、光面内质网和粗面内质网，但神经内分泌囊泡结构很少或没有。细胞核直径约4～5μm，圆或椭圆，核膜完整，往往局部有不规则突起，核仁有或没有，核染色质分布不均，有边聚现象。结论1．IND的病变神经元分布与肉眼病变肠段分布有不平衡性，术后EC发生率高，切缘仍有IND病变以及经肛门手术是术后反复EC的危险因素，IND的切除范围仍有不确定性。2．NSE、Cathepsin-D和S-100三种免疫组化具有互补性，可以分别显示IND的神经丛结构，神经丛内神经元结构数量，神经丛神经纤维增生情况，从而能够对IND进行准确的判断。3．电镜下，IND病变神经元结构与正常不同，胞浆内神经内分泌囊泡的减少或缺乏，伴有核染色质边聚现象。