第一部分脂联素基因多态性与心血管疾病相关性的Meta分析一、研究背景个体化医疗的模式已被普遍接受,而科学可靠的循证医学最新研究结果是指导有效进行个体化医疗的必要条件。基因多态性或单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs)是人类个体对疾病易感性和治疗药物反应差异的本质特征之一,是疾病风险预测和指导个体化用药的重要生物标志。人类脂联素基因位于染色体3q27,全基因组扫描推测此区域是代谢综合征、2型糖尿病和心血管疾病(Cardiovascular Diseases, CVDs)的易感区域,而且有较大频率的多态性。脂联素基因SNPs与CVDs密切相关,国内外已有大量研究予以报道,但结果尚有争议。Meta分析可以对具有相同研究目的的多个独立研究结果进行定量合并和综合评价,以弥补单个研究的不足,是循证医学的主要研究方法。本文在全面检索脂联素基因SNPs与CVDs相关性研究文献的基础上进行Meta分析,以期得出更为科学和客观的结论,为CVDs的个体化防治提供更科学准确的依据,并试图发现一些单个研究中未曾发现的问题,为进一步研究提供改进策略和新的思路。二、研究方法全面检索2011年4月前PubMed、EMBASE和Science Citation Index Expanded数据库中所有有关脂联素基因SNPs与CVDs相关性研究的文献资料。按制定的纳入和排除标准筛选文献,并对文献质量进行评价；提取相关数据,检验各研究间的异质性、进行亚组分析并探索异质性来源；用Logistic回归评估各SNPs与CVDs关联的总体效应；对关联效应有统计意义者,选择最佳遗传模式计算合并效应值(Odds Ratio, OR)及其95%可信区间(95%Confidence Interval,95%CI),并对合并后的OR值及其95%CI进行统计学检验；利用漏斗图、Egger’s和Beeg’s检验检测发表偏倚,对研究结果进行敏感性分析,评价Meta分析结果的稳定性和和可靠性。三、研究结果经检索和筛选后得到符合纳入标准的研究论文26篇,涉及17个脂联素基因SNPs位点与CVDs相关性。其中针对4个SNPs位点(rs1501299(+276G>T)、 rs2241766(+45T>G)、rs266729(-11377C>G)和rs822396(-3971A>G))与CVDs相关性研究文献的数量(5个(含)以上)可满足Meta分析的要求,对其分别分析结果如下：18个合格研究涉及SNP rs1501299(+276G>T)与CVDs相关性,包含5365个病例和10241个对照。Logistic回归分析评估脂联素基因SNPrs1501299与CVDs关联的综合效应显示,脂联素基因SNP rs1501299与CVDs在总体上无明显相关性(p=0.36)。亚组分析显示,针对普通人群的各研究之间没有明显异质性,且脂联素基因SNP rs1501299与CVDs无明显相关性(p=0.85),即使排除低质量研究也无统计意义(p=0.78)。针对2型糖尿病患者的7个研究包含1433个病例(有CVDs的2型糖尿病患者)和2621个对照(无CVDs的2型糖尿病患者),亚组分析结果显示各研究间几乎没有异质性,且综合效应分析显示,该亚组SNPrs1501299与CVDs有较强的相关性(p=0.04)；按照隐性遗传模式(TT vs. TG+GG)合并统计量,计算并检验其95%CI,结果为OR=0.74(95%CI:0.58,0.94; z=2.47,p=0.013)；发表偏倚和敏感性分析显示结果稳定可靠。15个合格研究涉及SNP rs2241766(+45T>G)与CVDs相关性,包含5151个病例和8740个对照,各研究之间存在明显异质性。按研究对象的种族分层后,以高加索人为研究对象的高质量研究之间的异质性在统计学可接受范围,综合效应分析显示,SNP rs2241766与CVDs无明显相关性(p=0.84)。因此,现有证据尚不能判定SNP rs2241766与CVDs是否关联。20个合格研究涉及脂联素基因SNP rs266729(-11377C>G)与CVDs相关性,包含6401个病例和11897个对照,各研究之间存在明显异质性。经分层分析无法将异质性降低到统计学可接受范围,无法进行有意义的分析,故只进行描述性统计。认为现有证据尚不能判定SNPrs266729与CVDs是否关联。5个合格研究涉及SNP rs822396(-3971A>G)与CVDs相关性,包含2582个病例和3611个对照。虽然各研究间无明显异质性,但综合效应分析显示SNPrs822396与CVDs无明显相关性(p=0.44)。因此,现有证据显示脂联素基因SNPrs822396与CVDs无明显相关性。四、结论本文分别对脂联素基因4个SNPs位点(rs1501299、rs2241766、rs266729和rs822396)与CVDs相关性研究的文献进行Meta分析。结果表明,在2型糖尿病患者,SNPrs1501299与CVDs具有相关性。脂联素基因SNPrs1501299(+276G>T)以隐性遗传方式对CVDs具有一定的保护作用,即基因型为TT纯合子突变者,其发生CVDs的概率相对较低(OR=0.74,95%CI:0.58～0.94,p=0.013);而在普通人群,尚无足够证据证明SNPrs1501299与CVDs具有相关性。对于SNPs位点rs2241766和rs266729,目前也无充分证据表明其与CVDs具有相关性；现有研究显示脂联素基因SNP rs822396与CVDs无明显相关性。本结果对2型糖尿病患者制定个体化的CVDs预防方案提供了循证医学证据,为深入探索CVDs的发病机制提供了新的思路,也为今后研究脂联素基因SNPs与CVDs相关性提出了改进策略。第二部分脂联素改善心肌细胞胰岛素抵抗和氧化应激机制的研究一、研究背景胰岛素抵抗是肥胖、糖尿病、代谢综合征及CVDs的重要病理生理基础,也与心肌疾病的发生发展密切相关。体内外多种因素可致机体或敏感细胞胰岛素抵抗,而胰岛素抵抗状态常伴随氧化应激反应增强,其机制尚不清楚。脂联素是一种具有多种生物学效应的蛋白质激素,能增强外周组织的胰岛素敏感性,但其对氧化应激的作用尚不明确,作用机制也十分复杂。本研究用高浓度胰岛素诱导大鼠心肌细胞H9c2胰岛素抵抗,建立胰岛素抵抗心肌细胞模型；观察胰岛素抵抗心肌细胞氧化应激改变,并探讨脂联素对心肌细胞胰岛素抵抗和氧化应激影响及机制。二、研究方法用高浓度胰岛素诱导H9c2细胞胰岛素抵抗,并用葡萄糖消耗和葡萄糖摄取试验进行鉴定;利用DCFH-DA荧光探针原位检测细胞内ROS改变,并用不同抑制剂作用探讨ROS的来源；RT-PCR检测NADPH氧化酶(Nox)家族各催化亚基及细胞内主要抗氧化酶mRNA表达变化；Western blotting检测GLUT4.Nox4、抗氧化酶及相关信号分子表达水平变化。三、研究结果高胰岛素(200nM作用24小时)可诱导H9c2细胞胰岛素抵抗,其葡萄糖消耗和摄取能力均显著下降(p<0.01), GLUT4表达明显下调(p<0.05)：高胰岛素作用24h后,细胞内ROS明显增高(p<0.01),线粒体呼吸链抑制剂鱼藤酮(Rot)和Nox抑制剂(DPI)均能抑制高胰岛素诱导ROS产生,而DPI抑制作用更明显(p<0.01)；H9c2细胞中只有Nox1、Nox2和Nox4表达,经高胰岛素处理后,在mRNA水平,Nox4表达明显增强(p<0.05),Nox1和Nox2表达无明显改变；在蛋白质水平,高胰岛素诱导24h后,Nox4表达明显增强(p<0.05)。在mRNA水平,抗氧化酶Catalase表达无明显改变,而SOD1和Gpx1表达显著下降(p<0.05)；SOD1和Gpx1蛋白表达也明显下降(p<0.05)。高胰岛素作用24h后,磷酸化Akt(p-Akt)明显下降(p<0.05)；而高胰岛素作用24h后,p-Erkl/2显著增高(p<0.01)。浓度为5.0μg/mL的脂联素能部分恢复胰岛素抵抗细胞的葡萄糖消耗。5.0μg/mL脂联素单独作用于H9c2细胞24h,细胞内ROS无明显变化；而与高胰岛素组相比,经脂联素预处理后的高胰岛素组ROS明显下降(p<0.05)。单独使用脂联素作用于H9c2细胞24h,GLUT4的表达明显升高(p<0.05)；用脂联素和Erkl/2特异性抑制剂U0126预处理,均可部分恢复高胰岛素所致的GLUT4表达下降(p<0.05)。单独使用脂联素虽不能使Nox4表达发生明显改变,但经脂联素预处理,可部分下调高胰岛素所致的Nox4表达升高(p<0.05)；抑制剂U0126预处理也可部分下调高胰岛素所致的Nox4表达升高(p<0.05)。单独使用脂联素也可使SOD1和Gpx1表达明显升高(p<0.05)：同样,用脂联素和抑制剂U0126预处理,均可部分恢复高胰岛素所致的SOD1和Gpx1表达下降(p<0.05)。单独使用脂联素虽不能使p-Erk表达发生明显改变,但经脂联素预处理,可部分下调高胰岛素所致的p-Erk表达升高；同时,单独使用脂联素可使p-Akt的表达明显升高(p<0.05),经脂联素预处理,可部分恢复高胰岛素所致的p-Akt的表达下降(p<0.05)。四、结论高胰岛素能诱导大鼠心肌细胞胰岛素抵抗,同时伴氧化应激增强,而导致氧化应激增强的主要机制涉及Nox4表达增高和抗氧化酶受损；脂联素不仅能够改善胰岛素抵抗,也可缓解高胰岛素所致的氧化应激。Erkl/2和Akt信号转导通路参与了高胰岛素诱导的胰岛素抵抗和氧化应激,以及脂联素对胰岛素抵抗和氧化应激的作用。