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目的1. 建立吉非替尼（Gefitinib）耐药的EGFR突变肺腺癌H3255和HCC827细胞株,探究表皮生长因子受体（EGFR）旁路激活信号通路;2.建立B7-H3敲除的H3255和HCC827细胞株,探究B7-H3信号对EGFR信号的交联调控。方法1. 采用Gefitinib浓度梯度递增法逐步诱导建立H3255和HCC827肺癌耐药株根据OD值计算细胞存活率（VR）,根据药物VR,由药物浓度的对数值与VR线性回归求出药物的半数抑制浓度（IC50）,并计算其耐药指数RI。2. 采用CCK8法分别检测H3255组,H3255/GR组,HCC827组,HCC827/GR组四组培养0h,24h,48h和72h的OD值,比较Gefitinib耐药细胞株H3255/GR,HCC827/GR和H3255,HCC827的增殖情况。3. 采用Western blot方法检测H3255,HCC827,H3255/GR,HCC827/GR四种细胞的EGFR下游信号分子AKT,ERK1/2,Stat3,p-AKT,p-ERK1/2和p-Stat3的表达,并分析比较耐药株与非耐药株之间的差异。4. 采用CRISPR/Cas9技术敲除H3255,HCC827,A549肺癌细胞上的B7-H3,并用流式细胞术和Western Blot分析技术进行敲除验证。5.采用CCK8技术检测B7-H3敲除肺癌细胞株与对照组细胞株的增殖差异,并检测其对Gefitinib药物敏感性改变,CPT诱导8h之后用流式细胞术（7-AAD/Annexin-V-APC双染）检测B7-H3敲除肺癌细胞株与对照组细胞株凋亡比例。6.采用Western blot方法检测H3255/KO,HCC827/KO与其对照组细胞EGFR下游信号分子AKT,ERK1/2,Stat3,p-AKT,p-ERK1/2和p-Stat3的表达,并分析比较两种细胞株信号的差异。结果1.本研究通过逐步增加Gefitinib剂量,成功从EGFR敏感突变的HCC827（Del E746-A750）细胞和H3255（L858R）细胞中获得HCC827/GR细胞和H3255/GR细胞。CCK8结果显示H3255的IC50为0.047±0.018μmol·L-1,H3255/GR的IC50为0.45±0.17μmol·L-1（RI=9.566±3.679）,HCC827的IC50为0.013±0.003μmol·L-1,HCC827/GR的IC50为0.18±0.03μmol·L-1（RI=13.242±2.848）,成功建立耐药株。2.H3255/GR和HCC827/GR细胞的增殖在培养24h、48h和72h时均显著低于非耐药株,具有统计学意义。3.H3255/GR和HCC827/GR的p-AKT,p-ERK1/2和p-Stat3与非耐药株相比未观察到明显变化。在H3255细胞中,Gefitinib对p-AKT和p-STAT3有明显的抑制作用,对t-STAT3,t-ERK1/2也有中度抑制作用,而对p-ERK1/2仅有轻度抑制作用。而在H3255/GR细胞中p-ERK1/2和p-Stat3表达水平亦无显著改变,但p-AKT表达显著下调。Gefitinib处理的HCC827细胞的p-ERK1/2,p-AKT和p-STAT3的表达显著降低,t-STAT3和t-ERK1/2的表达也有一定程度的降低,其中p-AKT和p-STAT3几乎失去表达。在HCC827/GR细胞中,Gefitinib处理后其p-AKT和p-STAT3表达几乎不被抑制,p-ERK1/2被中度抑制,Gefitinib几乎失去了对其信号的抑制作用4. 利用CRISPR/Cas9技术分别在H3255,HCC827和A549肺腺癌细胞中成功敲除B7-H3基因,用流式细胞术和Western Blot分析均验证已敲除B7-H3基因。5. B7-H3的缺失导致EGFR突变的HCC827和H3255细胞的增殖大幅下降。培养24h,48h和72h后,H3255,HCC827和A549细胞增殖均明显减少,CPT诱导的细胞凋亡明显增加。6. 当使用梯度浓度的Gefitinib处理时,B7-H3 KO导致H3255株和HCC827株与对照株的细胞存活率显著降低。此外,Gefitinib对HCC827/KO细胞的活力有剂量依赖性的抑制作用。相比之下,H3255/KO细胞在Gefitinib浓度为0.3μM表现出稳定的抑制作用。总之,这表明B7-H3敲除增加了肺腺癌细胞对EGFR-TKI的易感性。7. 我们检测了使用Gefitinib处理的H3255/KO和HCC827/KO细胞中ERK1/2,AKT和STAT3的总水平和磷酸化水平。B7-H3 KO的H3255细胞显著降低了t-ERK1/2,p-AKT,p-STAT3的表达,t-STAT3和p-ERK1/2的表达也有一定程度的降低,B7-H3KO联合gefitinib导致p-AKT和p-STAT3检测不到水平,而t-STAT3,t-ERK1/2和p-ERK1/2与H3255 KO细胞相比没有改变。在HCC827细胞中,无论是B7-H3 KO还是吉非替尼处理对t-STAT3,t-ERK1/2,p-AKT,p-ERK1/2和p-STAT3的调节几乎相同,但不完全相同。然而,B7-H3 KO联合gefitinib进一步降低了HCC827细胞中p-AKT,p-STAT3,p-ERK1/2和总STAT3,ERK1/2的表达水平。结论1.在本研究中,我们利用逐步增加Gefitinib浓度法成功建立了Gefitinib耐药株H3255/GR和HCC827/GR株。PI3K/AKT,JAK2/STAT3和Raf/MEK/ERK1/2三种信号通路在H3255和HCC827细胞间的EGFR下游信号通路中有不同程度的参与。H3255/GR和HCC827/GR细胞中JAK2/STAT3级联,HCC827/GR细胞中PI3K/AKT通路可被充分激活,而H3255/GR细胞中PI3K/AKT通路和HCC827/GR细胞中Raf/MEK/ERK1/2级联则可通过EGFR信号至少部分激活,在H3255细胞中,RAS/RAF/MEK/ERK1/2通路在EGFR下游信号通路中没有发挥明显的功能优势。EGFR突变亚型Del E746-A750和L858R之间存在旁路激活的差异。2.B7-H3诱导的信号通路包括RAF/MEK/ERK1/2,PI3K/AKT/mTOR和JAK2/STAT3,在肺腺癌中与EGFR信号通路重叠。在本研究中,我们发现CRISPR/cas9介导的B7-H3敲除（KO）显著降低了H3255（L858R）,HCC827（Del E746-A750）和A549（EGFR野生型）肺腺癌细胞的增殖和凋亡。B7-H3敲除之后比H3255和均对Gefitinib的敏感性。B7-H3 KO导致H3255细胞中ERK1/2,AKT和STAT3的总量和磷酸化水平显著降低,而在HCC827细胞中,其作用与吉非替尼相当。Gefitinib与针对ERK1/2,AKT或STAT3的特异性抑制剂联合使用进一步表明,EGFR信号在H3255细胞中不足,而在HCC827细胞中与交联信号在功能上重叠。综上所述,我们的研究揭示了B7-H3诱导的和EGFR信号在肺腺癌细胞中与两个突变等位基因Del E746-A750和L858R的信号转导和交联的存在差异。