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蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus2,BBWV2)在我国广泛发生,对许多经济作物造成严重危害。为了弄清BBWV2在寄主植物体内的细胞间转运机制,本论文应用电子显微镜对BBWV2的细胞病理结构进行了观察,并应用免疫胶体金标记技术对病毒运动蛋白VP37进行了亚细胞定位。为了进一步研究植物细胞骨架与病毒胞内运输的关系,分别以烟草BY-2悬浮培养细胞和蚕豆叶肉细胞为材料,制备了两种细胞的原生质体,初步建立了原生质体细胞微管和微丝骨架的标记方法,并研究了抑制剂Oryzalin和Latrunculin B处理对细胞骨架的影响。以上工作取得的主要结果如下:
将BBWV2的分离物PVl31接种昆诺藜(Chenopodium quinoa),透射电镜下观察感病细胞的超薄切片,发现PV131主要引起三种典型细胞病变:膜结构增生、细胞质内病毒结晶体、细胞质中的管状结构聚集体。此外在胞间连丝处发现了穿越细胞壁的小管结构,病毒粒子排列其中,证明了BBWV2的胞间运动机制与同科的豇豆花叶病毒和葡萄扇叶病毒类似,完整病毒粒子通过胞间连丝处小管进行运输。而细胞质中的管状结构由病毒粒子组成,仅是病毒的一种聚集方式,与病毒的胞间运动无关。利用免疫胶体金标记技术研究了VP37蛋白在感病细胞内的定位,胶体金颗粒主要分布于细胞质内和细胞壁胞间连丝处小管结构上,说明VP37蛋白是小管结构的主要成分。
用酶解法分别制备了烟草BY-2悬浮培养细胞和蚕豆叶肉细胞的原生质体,所得原生质体形态完整,活力高。用TRITC-鬼笔环肽对微丝骨架进行荧光染色,激光共聚焦显微镜显示了原生质体中微丝精细排列的均匀网络结构。用10μmol/L和20μmol/L的Latrunculin B处理原生质体,共聚焦成像显示了微丝解聚和微丝骨架分布的动态过程。用小鼠β微管蛋白单克隆抗体间接免疫荧光标记原生质体中的微管骨架,共聚焦成像显示了清晰的均匀网络结构,用10μmol/L的微管解聚剂Oryzalin处理原生质体l小时后,微管骨架被完全破坏,只能看到点状荧光斑点或极少量的丝状片段结构。以原生质体为材料建立的微丝和微管骨架标记方法,为进一步研究植物细胞骨架功能以及病毒的胞内运输奠定了基础。