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七鳃鳗(Lamprey)血清含有大量免疫相关分子如:C3、C1q、VLRB分子等,参与天然免疫以及适应性免疫防御,保护宿主抵御大量外来病原体的入侵。血清中serpin分子属于补体成分,通过抑制补体经典激活途径、凝集素途径中C1分子,在补体系统中发挥重要的调节作用。七鳃鳗serpin(L-serpin)在病原体刺激后其表达量明显上调,说明L-serpin可能参与病原体感染时的免疫防御过程。序列分析结果表明,L-serpin CDS全长为1433 bp,开放阅读框为1371 bp,编码456个氨基酸,包含有1个serpin结构域(Serine protease inhibitor domain)。L-serpin由3个β-片层和8个α-螺旋以及一个暴露的反应中心环(RCL)组成,位于RCL区域的靶蛋白识别位点P1、P1’的氨基酸残基为苏氨酸-丝氨酸。利用生物信息学相关软件预测和分析L-serpin编码氨基酸序列的结构特征、理化性质。L-serpin属于分泌蛋白,不存在跨膜结构,包含1个N-末端信号肽和1个N-型糖基化位点。进化树分析L-serpin属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族F分枝。PCR扩增L-serpin基因,构建到pCold?原核表达载体中,诱导大量rL-serpin蛋白用于多克隆抗体的制备和功能研究。利用半定量分析和免疫印迹方法鉴定L-serpin在七鳃鳗的鳃、神经轴体、肝、肠、肾、心、白细胞以及血清中都有表达,且在神经轴体、肝、白细胞中表达量相对较高。利用实时定量PCR和Western Blot的方法得知,七鳃鳗腹腔注射鳗弧菌、金黄色葡萄球菌和PolyI:C后,其体内的L-serpin表达上调。值得注意的是,在鳗弧菌刺激时,L-serpin表达量变化最为明显,并在8h时达到峰值(P<0.01)。通过免疫荧光证明,L-serpin主要定位于白细胞和肝细胞的胞浆中。利用点突变方法,将L-serpin与蛋白酶识别活性位点P1、P1’分别进行突变,随之进行蛋白表达以及纯化,并利用表面等离子共振与免疫共沉淀方法确定七鳃鳗血清中L-serpin-WT蛋白与七鳃鳗补体分子丝氨酸蛋白酶C1q蛋白存在相互作用,而突变体则失去了相互结合作用。通过流式细胞术、高内涵筛选检测和CCK8检测实验得知,L-serpin会抑制血清对靶细胞的杀伤作用。在体外条件下,利用QPCR和高内涵检测方法得知,在细胞中过表达L-serpin和外源性添加rL-serpin可以抑制LPS诱导的炎症因子产生和细胞死亡。通过免疫荧光与表面等离子共振方法证明了原核重组的L-serpin(rL-serpin)蛋白可结合革兰氏阴性菌表面标记物LPS。并通过菌结合实验证明L-serpin具有与包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌在内的多种微生物结合能力。综上所述,七鳃鳗serpin属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的F分枝,具有典型的serpin结构域和三维构象特征。阐明了L-serpin在病原体感染的天然免疫防御过程中,不仅通过七鳃鳗C1q分子参与免疫过程,并且可通过识别菌等外来病原体,发挥抗菌抗炎的功能,为七鳃鳗补体分子参与防御病原体感染的研究提供了新视角。