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研究背景与目的:皮肤创面愈合是涉及一系列生物学进程的复杂过程,其中包括了修复细胞的增殖与迁移、创面缺损再上皮化、胶原再生和新生血管化。糖尿病、肥胖、持续感染和使用皮质类固醇等多种因素会导致皮肤创面难以愈合,最终形成慢性皮肤创面。慢性创面是指在受伤后30天内未达到解剖和功能完整性的创面,最终患者可能因创面感染而导致截肢甚至死亡等严重后果。目前,我国海上事业飞速发展,海上作战人员以及沿海地区居民的开放性损伤极易受到海水浸泡。海水的主要化学成分是氯化钠,同时还包含了不同比例的氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸镁等无机盐,全球海水的平均盐度为34.7,pH为8-8.4,呈现出明显的高渗碱性状态。此外,海水中含有大量微生物,尤其是革兰氏阴性菌,上述特性决定了皮肤创面在海水中长时间浸泡将导致组织坏死和感染,延长皮肤创面的愈合时间,使其成为难愈性战创伤创面。同时,习主席提出中国要全面建成世界一流海军的强军梦想,未来我军出海规模和次数将不断增加,因此,海水浸泡伤的治疗对于海军具有重要的现实价值和深远历史意义。但遗憾的是目前海水对皮肤创面的影响及其机制的报道仍然较少。干细胞疗法是目前细胞疗法应用于慢性伤口治疗的新热点。脂肪来源的干细胞(a dipose-derived stem cells,ADSCs)是源于脂肪组织且具备分化干性的原始细胞。脂肪干细胞可以趋化聚集至皮肤受损部位,并多向分化为附件组织、新生血管、角质形成细胞等多种细胞类型修复受损皮肤。同时,ADSCs可旁分泌多种生长因子,其具备下调创面局部炎症,加快创面再生血管化,明显加快创面愈合的作用。但现在还没有脂肪干细胞应用于海水浸泡创面修复的相关报导。本研究通过人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells,hADSCs)与人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)或人表皮细胞永生化细胞系(human immortalized keratinocytes,HaCaT)在模拟海水的环境下进行共培养,探讨人脂肪干细胞对海水浸泡细胞功能的影响。随后,我们建立了小鼠全层皮肤缺损海水浸泡模型,通过多点注射人脂肪干细胞,探究其对海水浸泡创面的修复作用及其潜在机制。研究方法:1.选取5名健康女性腹部皮下抽脂后组织,随后添加至消化酶溶液中,消化、离心、重悬等步骤铺板培养。随后,镜下观测hADSCs细胞形态;流式细胞术判定hADSCs标志物(CD29,CD105,CD90,CD49d,CD45,CD34,HLA-DR)概况;成脂和成骨诱导培养基诱导hADSCs分化鉴定其多向分化能力。2.通过CCK-8试剂盒检测不同浓度海水对HUVEC和HaCaT细胞增殖活力的影响,从而确定一个合适的海水抑制浓度用于后续研究。随后,利用Transwell小室将hADSCs与HUVEC或HaCaT细胞共培养以模拟创面修复的再上皮化效应和新生血管化效应,通过EdU细胞增殖实验和细胞划痕实验,探究海水及hADSCs共培养对HUVEC和HaCaT细胞增殖与迁移能力的影响。3.建立全层皮肤缺损创面模型,并分为对照组、SW组、SW+DMEM组、SW+hADSCs组,对四组小鼠创面进行不同的干预措施,观测创面愈合效率。随后,创面切片HE、Masson染色、免疫组化染色微观评估创面修复效果。最后,生物信息学分析探讨潜在的分子机制并通过Western blotting和qPCR技术检测创面EGFR、VEGFR蛋白表达情况以及MEK/ERK信号通路激活情况。结果:1.倒置显微镜下观察hADSCs细胞形态显示:hADSCs呈现出与成纤维细胞类似的长梭形形态,且培养过程中细胞集落呈放射状、螺旋状生长。多向分化实验结果显示:提取细胞顺利分化为成骨细胞与脂肪细胞,证明此细胞具备分化干性。流式细胞术结果显示:CD29、CD49d、CD90、CD105表面标志物呈强阳性,表达率分别为99.4%、98.4%、99.2%、92.9%。而 CD34、CD45、HLA-DR 表面标志物呈阴性。2.CCK-8实验证实在10%海水浓度实验培养基的培养下,HUVEC与HaCaT细胞的增殖活力始终受到显著的抑制,并且随着培养时间的延长,抑制效应始终持续存在。EdU细胞增殖实验和细胞划痕实验结果显示:在10%海水浓度下,HUVEC和HaCaT细胞增殖和细胞迁移能力受到显著的抑制。而hADSCs共培养逆转了这一抑制效应,增强了 HUVEC和HaCaT细胞的增殖活力和迁移能力。3.体外实验结果显示:海水浸泡明显延缓了皮肤全层缺损创面的愈合,hADSCs注射治疗促进了海水浸泡创面的愈合效率。HE和Masson染色切片结果显示:相较于对照组与SW+hADSCs组,SW组修复皮肤厚度、毛囊、汗腺等皮肤附属物再生以及胶原沉积效果显著下降。免疫组化与免疫荧光染色切片结果显示:hADSCsk可分化为皮肤干细胞和血管内皮细胞,促进创面愈合。同时,相较于对照组与SW+hADSCs组,SW组Ki67、CK19和CD31在皮肤创面修复中的表达显著降低,增殖细胞数目显著下降,创面再上皮化与再生血管化明显延缓。生物信息学剖析hADSCs与内皮细胞的差异基因,共有9676个差异基因。后续GO注释及KEGG富集分析结果显示上调差异基因首要富集于遗传信息复制通路、蛋白质结合、细胞有丝分裂周期等生物学进程;下调差异基因主要富集于细胞外基质和PI3K-Akt分子通路。PPI网络分析差异基因间作用网络,并筛选出节点度最高的20个核心基因,结果显示CDK1、CCNB1和CCNA2是上调差异基因前3个节点度最高的核心基因;FN1、COL1A1和COL1A2是下调差异基因前3个节点度最高的核心基因。最后,Western blotting检测修复创面EGFR与VEGFR蛋白表达,结果显示:相较于对照组与SW+hADSCs组,SW组修复创面EGFR与VEGFR蛋白表达量显著下降。qPCR检测创面Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和ERK通路的mRNA水平,结果显示:相较于对照组与SW+hADSCs组,SW组修复创面Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达水平显著下降,MEK/ERK信号通路激活受阻。结论:通过酶消法成功从脂肪组织中获得了高质量的hADSCs,为后续实验研究提供了种子细胞。体外实验证实海水浸泡会显著减少HUVEC和HaCaT细胞的增殖与迁移能力,而hADSCs共培养可逆转这一抑制现象,促进HUVEC和HaCaT细胞的增殖与迁移能力。体内实验证实海水浸泡会显著阻碍创面的修复,而hADSCs可分化为血管内皮细胞、皮肤干细胞等多种细胞类型进行修复,并可加速修复细胞的增殖、创面再上皮化与新生血管化,进而促进缺损皮肤组织的修复。此外,hADSCs可促进海水浸泡创面EGFR与VEGFR蛋白表达,从而调节MEK/ERK通路的激活,促进创面愈合。