第一部分:电刺激清醒小鼠上矢状窦区硬脑膜模拟偏头痛相关行为学研究目的:偏头痛动物模型的建立可以帮助我们探究偏头痛的发生机制,寻找潜在的治疗靶点,目前为止,尚没有任何一种动物模型可以模拟出偏头痛发生的整个阶段。临床上偏头痛患者不仅具有头痛还伴有畏光、不愿活动等特征,本实验旨在通过电刺激清醒小鼠上矢状窦区硬脑膜建立一种小鼠头痛模型,并验证其具有偏头痛样的相关行为。方法:C57小鼠通过手术暴露上矢状窦区硬脑膜,并安置电极,预实验给予不同强度电刺激,通过观察小鼠行为学表现确定最适强度,同时在麻醉状态下通过激光散斑血流成像仪验证该强度是否会引发既往文献报道的硬脑膜血流改变。最后通过手术建立69只C57小鼠模型,随机将其分为3组,分别为:组1为假刺激+生理盐水组(n=23);组2为电刺激+生理盐水组(n=23),组3为电刺激+舒马曲普坦组(n=23)。对这三组小鼠进行疼痛行为观察、畏光实验、以及水迷宫运动实验,从而验证该三组小鼠是否具有偏头痛样的行为学表现。结果:通过预实验确定电刺激小鼠的强度为0.5mA/2Hz,麻醉状态下该强度可以模拟出既往报道的血流变化。相比组1,组2给予电刺激后,小鼠表现出用后爪或者前爪搔抓头皮和眼眶皮肤的时间明显增长,在畏光实验中在光亮部分停留时间变短,在黑暗及光亮之间穿梭次数减少,以及在运动实验中表现为运动距离减少,组间差异均具有统计学意义。当组3提前给予舒马曲普坦腹腔注射后,可以不同程度的抑制上述行为学的变化。结论:电刺激清醒小鼠上矢状窦区硬脑膜可以模拟出类似于偏头痛样的行为学表现,为将来药物研究的行为观察提供更多参考指标。第二部分:重复电刺激清醒小鼠上矢状窦区硬脑膜时痛觉敏化形成特点及机制目的:慢性偏头痛给患者带来极大的疾病负担,目前制约慢性偏头痛新的治疗手段发展的重要瓶颈之一就是缺乏有效的预测性动物模型。痛觉敏化作为偏头痛的一项特征样表现,目前具体机制尚不清楚,本研究旨在通过重复电刺激清醒小鼠上矢状窦区硬脑膜构建慢性偏头痛模型,并初步探索偏头痛痛觉敏化特点及机制。方法:将24只造模后小鼠随机分为三组,组1:假刺激+生理盐水组;组2:电刺激+生理盐水组;组3:电刺激+舒马曲普坦组。Vonfery纤维丝测量电刺激/假刺激后小鼠足底的机械痛阈变化,并麻醉灌注取脑进行TNC区以及高颈段的Fos蛋白染色。再将32只小鼠随机分为4组:组1:假刺激+生理盐水组;组2:电刺激+生理盐水组;组3:电刺激+舒马曲普坦组;组4:电刺激+托吡酯组,术后恢复一周后,每天分别给予四组腹腔注射生理盐水、舒马曲普坦或托吡酯,分别在1、3、5、7、9天给予电刺激或假刺激,刺激前测量小鼠后爪机械痛阈,分别于第1天以及第10天通过热板测量热痛阈潜伏期,在第10天用软刷轻刷小鼠足底后,灌注取脑,取脊髓腰膨大以及脑组织,做脊髓腰膨大以及RVM区Fos免疫荧光染色。结果:单次电刺激小鼠硬脑膜相比与假刺激组可以引起小鼠后爪足底机械痛阈下降,以及TNC区、高颈段区域大量Fos蛋白表达,提前给予腹腔注射舒马曲普坦可以有效抑制机械痛阈的下降,并抑制TNC区以及高颈段区域Fos蛋白表达。重复电刺激硬脑膜可以引起小鼠后爪足底机械痛阈的进行性下降,每天给予腹腔注射舒马曲普坦并不能抑制该下降趋势,每天给予托吡酯则可以有效抑制后爪足底痛阈的下降,第10天电刺激+托吡酯组热痛阈潜伏期明显长于电刺激+生理盐水组以及电刺激+舒马曲普坦组,差异具有统计学意义,腰膨大区Fos荧光染色显示,电刺激+舒马曲普坦组以及电刺激+生理盐水组Fos蛋白表达量明显高于电刺激+托吡酯组,在RVM区的Fos染色也得到了相同的结果。结论:1.单次电刺激清醒小鼠上矢状窦区硬脑膜可以模拟急性偏头痛的痛觉敏化,并且该效应可以被舒马曲普坦所抑制。2.重复电刺激清醒小鼠上矢状窦区硬脑膜可以出现痛觉敏化进行性加重,每天给予舒马曲普坦注射无法抑制慢性痛觉敏化的发展,而托吡酯可以有效抑制慢性痛觉敏化。3.电刺激硬脑膜模型所诱导的痛觉敏化可能与RVM区域的调节有着密切的关系。4.托吡酯的治疗作用可能与抑制RVM区域神经元的激活有关。第三部分急性睡眠剥夺显著加重硝酸甘油所致的小鼠痛觉敏化目的:睡眠不足以及偏头痛现已成为困扰全球的公共卫生问题。睡眠不足可以诱发偏头痛的发生,而偏头痛患者头痛发作时又常常喜欢卧床休息。那么急性睡眠障碍是否会影响头痛的程度以及持续时间呢,本研究以小鼠硝酸甘油模型为基础,探究急性睡眠剥夺对于小鼠痛觉敏化的影响。方法:第一部分:将32只C57小鼠随机分为4组:睡眠剥夺+生理盐水组,睡眠剥夺+硝酸甘油组,无睡眠剥夺+硝酸甘油组,无睡眠剥夺+生理盐水组,给予睡眠剥夺6小时或无干扰6小时后,四组小鼠分别腹腔注射硝酸甘油或生理盐水,Von-Frey纤维丝以及热板试验分别每隔半个小时测量小鼠后爪机械阈值以及热痛阈潜伏期,持续测量6小时。再重取24只小鼠先重复上述流程,而后分别在腹腔注射后2小时、4.5小时分批处死,取TNC区以及高颈段,进行免疫荧光Fos染色。第二部分:再重新取32只小鼠随机分为4组:生理盐水+睡眠剥夺组,生理盐水+无睡眠剥夺组,硝酸甘油+睡眠剥夺组,硝酸甘油+无睡眠剥夺组,在腹腔注射生理盐水或者硝酸甘油后再予以睡眠剥夺6小时或无干扰6小时,6小时后测足底机械痛阈以及热痛阈潜伏期。结果:只给予睡眠剥夺6小时并不引起小鼠机械痛阈以及热痛阈基线变化。提前给予睡眠剥夺可以显著延长硝酸甘油所引起的波谷持续时长(即最低阈值持续的时长),以及阈值下降的总时长。2小时TNC区以及高颈段Fos表达量睡眠剥夺+硝酸甘油组及无睡眠剥夺+硝酸甘油组显著高于其余两组,但两组间无统计学差异;4.5小时上述脑区域Fos表达量,睡眠剥夺+硝酸甘油组显著高于无睡眠剥夺+硝酸甘油组,且差异具有统计学意义。先给腹腔注射时,硝酸甘油+睡眠剥夺组后爪机械痛阈明显低于其余三组。结论:急性睡眠剥夺可以显著加重硝酸甘油所致小鼠的痛觉敏化。