前言白血病是血液系统的一种恶性肿瘤，和其他肿瘤一样，它的发生、发展与细胞凋亡紊乱有密切的关系。生存素（survivin）是1997年由Ambrosini等利用效应细胞蛋白酶受体-1（effector cell protease receptor-1，EPR-1）cDNA在人类基因组文库中筛选克隆出来的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族新成员。Survivin具有细胞周期调控和凋亡抑制双重功能，是迄今发现最强的凋亡抑制因子。目前已发现，survivin在转化细胞株和人体内许多恶性肿瘤中均有明显表达，其与肿瘤发生、发展及预后的关系已成为肿瘤研究的热点。在白血病的相关研究中发现，survivin在人类各型白血病中表达上调，在耐药细胞系中的表达明显增加，并且，survivin阳性病例比阴性者对化疗药物的敏感性差，骨髓的缓解率低，生存期短，提示survivin是决定造血系统肿瘤预后的重要因素之一。新生毛细血管的形成对肿瘤细胞的增殖和生长是必不可少的，也是肿瘤侵袭转移的必须条件。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是促进血管内皮细胞有丝分裂的细胞因子，也是血管新生最重要的正调控因子，1989年由Gonnolly等从牛的正常垂体滤泡细胞中分离出来。人的VEGF最先从人白血病细胞系HL-60细胞中克隆出来。VEGF具有促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性和抑制细胞凋亡的功能。近年来，VEGF与血液系统恶性疾病的关系日益受到关注，不少研究已表明血液系统恶性肿瘤患者血清内VEGF的高水平表达与肿瘤的恶性程度、治疗及预后都有着密切的关系。其表达水平已成为白血病一个独立的预后因素。目前，survivin和VEGF在实体肿瘤组织中表达的相关性已受到越来越多的重视。研究发现，内皮细胞中表达的VEGF可诱导和促进survivin的高表达，而survivin的表达上调是内皮细胞在血管生成过程中维持生存活力的必要条件。但是，关于survivin和VEGF在白血病中表达相关性的研究还很少见。本实验应用RT-PCR方法研究白血病病人骨髓中survivin和VEGF的表达情况，探讨两者表达之间是否存在相关性，希望能为白血病发病机制的阐明提供一些线索。实验材料与方法一、实验材料收集2005年11月至2006年4月中国医科大学第一临床医院血液科门诊及病房的76例做融合基因检测的白血病患者骨髓标本。急性白血病患者45例，其中初治急性髓细胞白血病（AML）25例，初治急性淋巴细胞白血病（ALL）9例，缓解组8例，复发组3例。慢性粒细胞白血病（CML）31例，其中慢性期15例，加速期9例，急变期7例。对照组为非血液系统恶性疾病患者，共12例。其中溶血性贫血2例，巨幼细胞贫血3例，缺铁性贫血7例。全部病例经骨髓细胞形态学检查确诊，并同时作免疫分型及融合基因检查。二、实验方法1、分离单个核细胞无菌操作取枸橼酸钠抗凝的骨髓液4ml，PBS液稀释。加淋巴细胞分离液4ml，常规分离骨髓单个核细胞（MNC）。2、提取细胞总RNA取塑料离心管底部的细胞约5—10×10⁶，加入到经灭菌的1.5ml塑料离心管中，加入1ml Trizol，充分混匀室温放置5分钟。加入氯仿0.2ml，振荡混匀，室温放置3分钟，11000r／min，4℃，离心15分钟。缓慢吸取上层水相，加入到新1.5ml塑料离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10分钟，11000r／min，4℃，离心10分钟。弃去上清，然后加入75％乙醇0.5ml，充分洗涤管盖、管壁以及管底的沉淀，7500r／min，4℃，离心10分钟。弃去上清，室温干燥10分钟。加入经DEPC处理高压消毒的双蒸水6—15μl，充分溶解RNA沉淀，-20℃冰箱冻存，准备用于逆转录反应。3、逆转录反应逆转录反应体系为20μl，包括细胞总RNA3μl，随机引物1.5μl（90ng），RNA酶抑制剂0.5μl（20U），5×逆转录反应缓冲液4μl，M—MLV反转录酶1μl（200U），DEPC水8μl，dNTPs（10mmol／L）2μl。反应条件为40℃，50分钟，99℃，3分钟。4、PCR反应反应体系为25μl，包括cDNA模板3μl，10×PCR缓冲液2.5μl，DEPC水15.8μl，正义链和反义链引物各1μl（10pmol），dNTPs（10mmol／L）1.5μl，Taq酶0.2μl（1U）。热循环条件：Survivin：94℃预变性5分钟；94℃变性35秒，66℃复性40秒，72℃延伸40秒，30个循环后，72℃再延伸7分钟，扩增片断长度为447bp。VEGF：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，60℃复性2分钟，72℃延伸3分钟，35个循环后，72℃再延伸7分钟，增片断长度为516bp、588bp和648bp。β-actin：94℃预变性5分钟；94℃变性35秒，66℃复性40秒，72℃延伸40秒，30个循环后，72℃再延伸7分钟，增片断长度为250bp。5、产物分析取10μl扩增产物，2％琼脂糖凝胶电泳（45mv，40min），溴化乙锭染色，紫外透射仪下观察结果并照相。三、统计学分析根据资料的性质选用X²检验，使用SPSS12.0统计学软件对实验结果进行分析及各组间的比较。实验结果1、Survivin和VEGF基因在急性白血病患者中的表达情况初治AL患者中survivin和VEGF基因的表达阳性率分别为70.59％（24／34）和55.88％（19／34），均高于对照组（P=0.008，P=0.041）。在缓解组其表达阳性率分别下降到25.00％（2／8）和12.50％（1／8），与初治AL组比较，差异均有统计学意义（P=0.038，P=0.047），与对照组比较均无统计学意义（P=1.000，P=1.000）。在复发组，survivin和VEGF基因的表达阳性率明显升高，均为100.00％（3／3），与对照组比较，差异均有统计学意义（P=0.044，P=0.022）；与初治AL组比较，差异均无统计学意义（P=0.548，P=0.257）。2、Survivin和VEGF基因在初治急性白血病患者中的表达情况Survivin基因在ALL组和AML组中的表达阳性率分别为77.78％（7／9）和68.00％（17／25），均高于对照组（P=0.030，P=0.032）；ALL组与AML组比较，差异无统计学意义（P=0.692）。VEGF基因在AML组中的表达阳性率为64.00％（16／25），明显高于对照组（P=0.013）；在ALL组中的表达率为33.33％（3／9），与对照组比较，差异无统计学意义（P=0.611）；ALL组与AML组比较，差异无统计学意义（P=0.139）。3、Survivin和VEGF基因在慢性粒细胞白血病患者不同临床分期中的表达情况Survivin基因在慢性期组的表达阳性率为26.67％（4／15），与对照组比较，差异无统计学意义（P=1.000）；在加速期和急变期survivin基因的表达阳性率明显上升，分别为77.78％（7／9）和85.71％（6／7），与对照组比较，差异均有统计学意义（P=0.030，P=0.020），其与慢性期比较，差异亦有统计学意义（P=0.033，P=0.020）。VEGF基因在慢性期、加速期和急变期的阳性表达率均显著高于对照组，差异有统计学意义（P=0.006，P=0.002，P=0.006），在加速期和急变期VEGF基因的表达阳性率与慢性期比较，差异均无统计学意义（P=0.615，P=0.637）。4、Survivin和VEGF基因表达的相互关系在初治AL患者中，survivin和VEGF基因表达双阳性者18例，阳性符合率为75.00％（18／24），在Survivin（+）组和Survivin（-）组VEGF基因阳性表达率分别为75.00％（18／24）和10.00％（1／10），两者差异有统计学意义（P=0.001）。在CML患者中，survivin和VEGF基因表达双阳性者16例，阳性符合率为64.00％（16／25），在VEGF（+）组和VEGF（-）组survivin基因阳性表达率分别为64.00％（16／25）和16.67％（1／6），两者差异无统计学意义（P=0.067）。讨论细胞凋亡也称程序化细胞死亡，是一种遗传控制的有计划的细胞自杀过程，是正常体细胞维持稳定的重要保护机制之一。凋亡受到促凋亡因子和抑制凋亡因子等多方面因素的影响。Survivin是迄今发现最强的凋亡抑制因子。体外实验表明，survivin对暴露于多种凋亡刺激因素的细胞均起到抑制caspases活性和细胞凋亡的作用。同时，survivin还通过与纺锤体纤维的结合，间接抑制caspases对纺锤体的水解作用，有利于保护有丝分裂细胞器的完整性，从而抑制细胞凋亡。此外，su-rvivin还可以与周期素依赖蛋白激酶Cdk₄结合，促使Cdk₄活化，细胞进入增殖周期，最终导致大量细胞无限制增殖。因此，survivin如果过度表达，会造成细胞增殖增加，凋亡减少，细胞增殖与凋亡的平衡打破，最终导致肿瘤的发生。已有研究发现survivin在肿瘤组织中有过量表达。本实验显示，在34例初治急性白血病患者中survivin基因的表达率明显高于对照组，这与Mori等采用RT—PCR法检测survivin mRNA在人类各型白血病中的表达情况相似，提示survivin可能与急性白血病的发病机制有关。Survivin在ALL中的阳性率有高于AML的趋势，但差异无显著性意义。Survivin在AML-M₃中的表达率明显低于其它类型。在缓解组，survivin基因的表达率明显下降，在3例复发的急性白血病患者中survivin的表达率升高，提示survivin与急性白血病的预后有关。可见，检测survivin基因的表达情况，有利于急性白血病的临床诊断和疗效评价。本实验发现，survivin在慢性粒细胞白血病（CML）中的表达与临床分期密切相关。在31例CML患者中，慢性期survivin的表达率与对照组无显著性差异，在加速期和急变期survivin的表达率明显升高，显著高于慢性期和对照组，这与Enrico C等检测的不同时期CML患者中survivin的表达结果一致。可见，随着慢性粒细胞白血病病程的进展，survivin的表达率明显升高，在原始细胞增多的加速期和急变期survivin的表达率高于以分化细胞为主的慢性期，提示survivin与细胞分化间可能存在某种联系。但其确切机制仍有待进一步研究。肿瘤细胞的生长和数目的增多需依赖于新生血管的形成。以往对血管新生的研究主要集中于实体瘤，近期的研究表明在血液系统恶性肿瘤中也存在着血管的新生。VEGF是血管内皮细胞强有力的丝裂原。近年有关文献表明，大部分恶性血液病细胞高表达VEGF。VEGF通过促使血管新生及自分泌、旁分泌等途径，促进白血病细胞增殖，并具有抑制细胞凋亡的功能。本实验显示，34例初治AL患者中VEGF基因的表达率高于对照组和缓解组。在复发组中，VEGF基因的表达率明显升高，显著高于对照组和缓解组。因此，对VEGF的检测，有助于病情的了解和预后的判断。VEGF基因在ALL组中的阳性率较AML组低，但两组间差异无统计学意义，有待于加大样本数以进一步研究。本实验结果显示，VEGF基因在CML患者中的表达率明显高于对照组，但慢性期、加速期和急变期之间表达率的差异无统计学意义，提示VEGF的表达与CML患者的临床分期无关。近年的研究证实，在正常的毛细血管内皮细胞中，无法检测出survivin但在刚形成的肉芽组织中它的表达明显升高，VEGF可通过上调survivin表达的机制促进血管内皮细胞增殖。VEGF在肿瘤血管生成过程中发挥的内皮细胞抗凋亡作用也依赖于其诱导的survivin表达上调，高表达的survivin抑制了各种指向caspase的凋亡机制，从而保护内皮细胞逃避凋亡。本实验显示，在34例初治AL患者中survivin和VEGF基因表达双阳性者18例，阳性符合率为75.00％，在survivin（+）组和survivin（-）组VEGF基因阳性表达率分别为75.00％和10.00％，两者差异有统计学意义，提示在初治AL组中survivin和VEGF基因表达存在相关性。但是，在31例CML患者中survivin和VEGF基因表达阳性符合率为64.00％，在VEGF（+）组和VEGF（-）组survivin基因阳性表达率分别为64.00％和16.67％，两者差异无统计学意义，提示在CML患者中survivin和VEGF基因表达无相关性。这与初治AL组中得到的结果不同。这可能是由于AL和CML的发病机制不同，也可能是由本实验样本数有限引起的差异。目前，关于慢性粒细胞白血病患者survivin和VEGF之间表达相关性的研究国内未见报道。本实验样本数有限，因此，两者之间的相关性仍有待于进一步的研究。目前，关于survivin和VEGF的研究尚存在许多问题需进一步研究解决。尽管如此，相信随着研究的深入，两者有望成为白血病的治疗靶向。结论Survivin和VEGF在急性白血病的初治组和复发组高表达，在缓解组其表达率显著下降，两者参与了急性白血病的发生、发展，并有助于判断预后。Survivin在慢性粒细胞白血病中的表达与临床分期密切相关，在原始细胞增多的加速期和急变期survivin的表达率高于以分化细胞为主的慢性期，提示survivin与细胞分化间可能存在某种联系。在初治急性白血病患者中survivin和VEGF的基因表达存在相关性，survivin在促进血管内皮细胞增殖方面起到一定作用。