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小菜蛾Plutella xylostella(L.)属鳞翅目菜蛾科,是十字花科蔬菜的主要害虫之一。由于小菜蛾生活史的特殊性,在生产上用药频繁,已对多种杀虫剂产生了抗药性,成为世界上最难防治的害虫之一,所以对小菜蛾的抗性机理研究就显得尤为重要。
本研究采用cDNA代表性差异分析(cDNA Represntational Difference Analysis,cDNARDA)方法,利用双向杂交体系,即分别以小菜蛾敏感品系为检测子、抗性品系为驱赶子和以小菜蛾抗性品系为检测子、敏感品系为驱赶子的杂交体系,对抗性品系和敏感品系的基因表达谱进行比较分析。
本文通过采用两种限制性内切酶做消减杂交筛选,第一次采用DpnⅡ限制性内切酶,经过三轮杂交后,从以敏感品系为检测子的杂交体系中筛选到一条序列与NCBI数据库中一些已知序列有很高的同源性。第二次我们采用HhaI限制性内切酶对小菜蛾抗药性差异基因继续筛选,并分别从敏感品系为检测子的杂交体系和以抗性品系为检测子的杂交体系中筛选到一些差异基因与NCBI数据库中一些已知序列有很高的同源性。利用RT-PCR技术对RDA筛选获得的同源性片段进行了验证。主要结果如下:
1、在以敏感品系为检测子的cDNARDA中,筛选到S39序列与已知S3A基因有很高的同源性;S35序列与已知S23基因有很高的同源性;M17与核糖体蛋白S7基因有很高的同源性;M35与核糖体蛋白S4有很高的同源性;M37与核糖体蛋白L23A有很高的同源性。
2、在以抗溴氰菊酯品系为检测子的cDNARDA中,筛选到一条序列K23与核糖体蛋白L7基因有很高的同源性。
3、除了得到上述与已知基因有较高同源性的序列外,还得到了29条在GenBank中找不到同源性的序列,他们的性质和功能有待进一步研究。
4、在分别以这些有较高同源性的序列根据保守序列设计引物进行RT-PCR扩增后,得到与这些片段大小相似的片段。测序分析后表明,RT-PCR扩增得到的序列与消减杂交后筛选得到的序列基本一致。
由于本研究使用的抗性品系是在敏感品系的基础上通过多代的药剂选择培养而成的,这些差异片段的获得说明药剂的选择作用导致了小菜蛾基因表达谱的变化,对这些差异表达基因的筛选和挖掘,为后续的抗性遗传机理研究,以及为害虫的抗药性监测和抗药性的有效治理工作提供理论基础和技术支持。