论文部分内容阅读
目的通过制备去毒附子及建立骨性关节炎大鼠动物模型,在去毒附子干预下,观察去毒附子对大鼠骨性关节炎的药效作用,探讨去毒附子在治疗骨性关节炎的可能机制。方法去毒附子的制备,通过HPLC法分析去毒附子的生物碱含量,并通过QTOF-MS分析方法测定其化学成分。体内实验中,将8周龄45只健康成年雄性SD大鼠随机分为3组,分别为空白对照组、模型对照组、去毒附子组,每组15只。其中空白对照组不予任何处理,其余2组大鼠通过关节腔注射碘乙酸(1.25g)建立骨性关节炎动物模型。去毒附子组采用灌胃方法给予去毒附子汤剂,空白对照组和模型对照组给予生理盐水灌胃。分别于给药4周后,经水合氯醛麻醉后,小动物成像拍摄及取大鼠双侧股骨标本分别进行组织病理学观察。体外实验中,取1月龄雄性SD大鼠10只,随机分为两组,分别为空白组和去毒附子组,每组10只。去毒附子组按大鼠每千克体重用药10g的剂量进行换算灌胃,其中空白组予0.9%生理盐水灌胃;1次/d,连续7d,末次灌胃(末次灌胃前禁食不禁水12h)2h后,麻醉动物,心脏取血,离心获取空白血清及含药血清。分别配置成浓度为5%、10%、15%、20%的空白血清及去毒附子含药血清。取空白组大鼠膝关节软骨进行细胞培养,甲苯胺蓝鉴定后,取第三代软骨细胞进行实验,分别加入不同浓度去毒附子含药血清(5%、10%、15%、20%)每个浓度10个复孔;对照组予以空白血清干预,培养24h、48h、72h后分别加入MTT新鲜溶液进行检测。结果(1)通过HPLC对去毒附子的药学分析,传统方法炮制过的白附片其乌头碱,中乌头碱和次乌头碱的含量明显降低;而白附片经久煎120min后乌头碱,中乌头碱和次乌头碱的含量进一步明显降低,其中乌头碱完全分解至检测不到。通过QTOF-MS分析,去毒附子主要有23种生物碱成分。(2)小动物成像观察,碘乙酸模型组关节软骨退变明显,关节表现为骨溶解,骨质增生,软骨表面不平整,尤其在胫骨平台表现明显。与对照组比较,胫骨平台骨密度下降明显(P<0.01)。去毒附子组关节软骨退变不明显,关节软骨面平整,关节间隙正常,与对照组比较,胫骨平台骨密度无明显统计学意义(P>0.05)。(3)组织病理学观察,模型组胫骨平台软骨被严重破坏,出现软骨缺失、软骨细胞坏死、类骨赘形成、软骨下骨暴露,并可见软骨下骨硬化、囊肿、骨小梁面积减少等现象。与对照组比较,Mankin评分显著增高(P<0.01)。去毒附子组关节软骨破坏减少,未见明显骨缺损,骨小梁部分减少,未见明显软骨下骨硬化、囊肿。与模型组比较,Mankin评分显著减少(P<0.01)。(4)软骨细胞增值方面:与空白含药血清相比,去毒附子含药血清可以促进软骨细胞的增值,并依赖浓度和时间的改变而变化,尤以10%血清浓度显著(P<0.01)。同样,与空白含药血清+MIA组相比,去毒附子含药血清+MIA组能明显降低碘乙酸对软骨细胞的破坏,尤其在培养24h和48h表现明显(P<0.05),表明去毒附子具有保护软骨细胞的作用。结论通过对白附片的制剂工艺改进,制备去毒附子,验证达到了去毒作用。药效研究发现,去毒附子具有保护软骨作用,并能促进软骨细胞的增值,达到了去毒保效的作用。