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目的:建立大鼠体外肝微粒体孵育体系，分别以非那西丁和双氯芬酸作为CYP1A2和CYP2C9的特异性探针药物，通过高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)分别测定大鼠肝微粒体体系中探针药物非那西丁和双氯芬酸的代谢产物对乙酰氨基酚和4-羟基双氯芬酸的浓度，计算肝微粒体中非那西丁和双氯芬酸的酶动力学参数，进而评价两种酶的活性。同时将不同体积百分浓度的肾康注射液和丹红注射液加入到孵育体系中，通过测定对乙酰氨基酚和4-羟基双氯芬酸的生成量，计算半数抑制浓度IC50来评价两种中药注射液在体外对CYP1A2和CYP2C9酶活性影响。
方法:建立体外肝微粒体孵育体系，优化色谱条件，测定对乙酰氨基酚色谱条件为采用Hypersil BDS C18柱(150 mm×4.6mm，5μm)，流速为0.8 mL·min-1，柱温为30℃，检测波长245 nm。流动相A为乙腈，B为50.0 mmol·L-1磷酸氢二钠缓冲液(pH4.5)，梯度洗脱;测定4-羟基双氯芬酸色谱条件为采用Hypersil BDS C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流速为0.8 mL·min-1，柱温为30℃，检测波长276 nm。流动相A为乙腈，B为50.0 mmol·L-1磷酸氢二钠缓冲液(pH4.5)，等度洗脱。分别优化肝微粒体体系的孵育时间、蛋白浓度，将探针药物非那西丁和双氯芬酸分别加入体系中，通过HPLC测定代谢产物对乙酰氨基酚和4-羟基双氯芬酸的浓度，以Lineweaver— Burk作图计算Vmax与Km值。并将不同体积百分浓度的肾康和丹红注射液加入到微粒体孵育体系中，通过测定对乙酰氨基酚和4-羟基双氯芬酸的生成量，分别计算出肾康和丹红注射液对CYP1A2和CYP2C9的半数抑制浓度(IC50)。
结果:经过优化孵育条件，并且经阳性抑制剂的验证，建立的肝微粒体孵育体系符合要求。在优化的色谱条件下，非那西丁与双氯芬酸及其各自内标和代谢产物对乙酰氨基酚和4-羟基双氯芬酸峰形良好，且酶反应体系中无其他内源性物质干扰。对乙酰氨基酚线性范围0.300～20.0μmol/L。日内、日间精密度均小于10％，准确度在85％～115％范围内，处理回收率大于85％，稳定性均小于10％;4-羟基双氯芬酸线性范围0.500～30.0μmol/L。日内、日间精密度均小于10％，准确度在85％～115％范围内，处理回收率大于85％，稳定性均小于10％。对乙酰氨基酚的酶动力学参数Vmax为Km为100.5μmol·L-1，1.06 nmol·min-1·mg protein-1;4-羟基双氯芬酸的酶动力学参数Km为17.1μmol·L-1，Vmax为1.25 nmol·min-1·mg protein-1，。肾康注射液对CYP1A2和CYP2C9的IC50分别为7.8％和5.9％。丹红注射液对CYP1A2无明显抑制作用，对CYP2C9的IC50为1.1％。
结论:本文建立的HPLC法测定大鼠体外肝微粒体孵育体系中CYP1A2和CYP2C9酶活性的方法简单、可靠、专属性好，可应用于药物对这两种酶活性影响的研究。建立了的大鼠肝微粒体孵育体系，以对乙酰氨基酚和双氯芬酸作为CYP1A2和CYP2C9酶的探针底物，测定两种酶的活性。通过考察，初步认为肾康注射液在体外对CYP1A2和CYP2C9均有抑制作用;丹红注射液在体外对CYP1 A2无明显抑制作用，对CYP2C9有抑制作用。