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前言 乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的公共卫生问题，全球范围内大约有3.5亿人慢性携带乙肝病毒。感染HBV后，其中部分病人发展为慢性乙型肝炎(CHB)，部分病人最终发展为肝硬化甚至肝癌，因此通过抑制HBV复制来控制CHB炎症持续活动的治疗非常重要。目前除干扰素之外，拉米夫定是另一类可有效抑制HBV复制的抗病毒药物，拉米夫定通过与HBV DNA聚合酶(P)基因结构域YMDD(酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸)结合来抑制病毒复制。但长期应用拉米夫定会诱发HBV DNA P基因变异，出现药物抵抗，从而限制了药效。因此拉米夫定长期应用效果、引起的HBV DNA P基因变异特点、此变异与基因型的关系、以及出现变异后的对策成为目前研究的热点。本文对拉米夫定1年的治疗效果、P基因变异特点、此变异与基因型的关系以及其他影响变异的因素加以研究。 实验材料与方法 一、实验材料： 1．受试对象及血清标本采集： 试验组：33例慢性乙型肝炎患者，每日口服拉米夫定100mg，疗程1年，分别在用药前、用药后6个月、用药后12个月时抽取血清放于-70℃冻存待检。 对照组：20例慢性HBV携带者，入选后抽取血清放于-70℃冻存待检。 2．实验试剂及设备： 门）弓 物设计：用 DNA STAR软件，依据 HBV DNA（AF100309）P基因设计了3条引物，分别命名为HBV381。HBV840、HBV801，序歹u分另u为 5＊TGCGGCGTITfATCATC’ITCCT－3’、5＼GT7’T’xAATGTATACCCAAAGAC－3＼5二CAGCGGCATAAAGG－GACTCAAG－3’，配成两对半巢式PCR弓物：HBV381／HBV840。HBV381／HBV801。用于测序的引物为 HBV381。 门川NA纯化试剂盒和测序反应试剂盒。 （3）PCR扩增仪（ABI Gene Amp PCR System 2400）。 （4）PCR扩增仪（AB Gen，Amp PCR System 9600）。 （5）自动序歹测序仪（AB1377）。 二、实验方法： 1．处理血清，提取HBV DNA。 2．半巢式PCR： 门）第一次扩增：反应体系50ul，产物453hP，反应过程为：94 CC 45秒、50℃30秒J72℃l分钟30秒，共30个循环。 ＊）第二次扩增：反应体系50al，产物415hp，反应过程为：94℃45秒、55℃30秒、72℃卫分钟，共30个循环。 门）用 DNA Markers验证半巢式PCR产物。 3．PCR产物纯化规序反应、沉淀及自动测序。 4．数据处理： 厂X总结拉米夫定的疗效J基因变异出现的时间，用SAS软件分析影响疗效和变异的因素。 （二）用 DNA STAR软件的 CLUSTAL V方法对HBV DNA P基因片段的种系发生、核着酸和氨基酸差异、变异类型进行分析。 门）用DNACICb由 软件分析出现P基因变异前后所编码的蛋白质的二级结构的差异。 ·二· 实验结果 1．拉米夫定治疗效果：按照ALT正常值最高上限（ULN人把试验组分成4组：35 X ULN、2－5 X ULN、IZ X ULN、＄IULN。如表二所示，各组间促进ALT正常化没有明显差异。在治疗后12个月，nhxg转阴率随着治疗前xu水平的升高呈直线上升，比率为72．41％（21／29）；但是HI3eAg血清转换（HBeAg（刁、HBeAb（十厂率却随着治疗前 ALT水平的升高呈直线下降，比率为 13．79％K／29人未发现 HBSAg血．清转换及转阴。在治疗后 6个月血清标本中未发现YMDD变异，在治疗后12个月血清标本中发现二例YMDD变异。 2．基因分型：对照组和试验组经半巢式PCR扩增后，对照组20个标本检出门个阳性，试验组用药前33个标本都为阳性，治疗后 6个月＊ 2个月分别有 22个标本阳性。如图 2、表 3所示：试验组治疗前和对照组检出 BJ：、D三个基因型，分别占22％j0％。28％（P＝0．000人未发现基因型 A、E＊、G土。基因型 D的分布与基因型B相当，其中在慢性HBV携带者中基因型D的分布仅次于基因型C，并且高于CHB患者中基因型D的分布。 3．YMDD变异：在对照组中发现了1例n28M变异；在拉米夫定治疗后6个月中未发现YMDD及n28M变异；在拉米夫定治疗后12个月发现了2例YVDD变异，这2例YVDD变异都伴有n28M变异，还发现了2例只有is28M的变异。 4．基因型对拉米夫定治疗的影响：如表4所示：基因型B在ALT正常化和HBeAg血清转换中的比率最高；基因型C在HBeAg转阴率和HBV DNA转阴率中的比率最高，但2例YVDD变异都发生在基因型 C中；基因型 D在 ALT正常化、HBeAg转阴率。HBeAg血清转换率JBV DN．人转阴率都占一定的优势。 ·3· 5．预测 YMDD变异株与 HBV野生株编码的蛋白质二级结构：如图4所示：在截取的氨基酸序列中YMDD对应的是70－73AA，n28M对应的是 47AA；在用药前未发生变异时 47AA和70J3AA蛋白质的二级结构都为转角，在发生变异后，70－73AA的转角结构变为折叠，47AA的转角结构没变。 讨 论 在本研究中，HBeAg血清转换率只有13．79％，与Lai对亚洲患者拉米夫?