论文部分内容阅读
PRMT5是一种蛋白质精氨酸甲基转移酶,在核糖体生物合成、高尔基体的组装、细胞生长、细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、细胞全能性及癌症发生中发挥着重要的作用。作为PRMT5的伴侣蛋白,MEP50在细胞生长、细胞周期、细胞分化、生长发育和癌症发生等方面发挥功能。基因编辑技术是通过在DNA靶位点上产生双链断裂,从而诱导基因产生同源重组修复或者非同源末端连接,实现对基因组中目的基因的编辑。本研究用TALEN、CRISPR/Cas9和NgAgo-gDNA三种不同的基因组编辑技术分别对青鳉的prmt5和mep50两个基因进行了基因编辑。（1）利用CRISPR/Cas9技术敲除青鳉mep50基因。为了避免脱靶效应的发生,在网站预测的gRNA靶位点中选择3个不同的gRNA靶位点,第一外显子处选择单靶位点,第二外显子处选择双靶位点。体外合成Cas9 mRNA和sgRNA后,对青鳉受精卵进行显微注射。观察Fo代胚胎生长情况,发现注射样品对胚胎发育有明显的毒性,胚胎畸形率为1.4%,死亡率高达16.61%。实验组与对照组相比,具有显著差异（P<0.01）。提取F0代胚胎基因组DNA后,PCR扩增含有靶位点的目的片段,T7EI酶切检测。检测结果显示,第一外显子序列无突变产生,第二外显子序列有突变产生。测序分析结果表明第二外显子上下游靶位点处有明显的突变产生,有碱基插入、碱基缺失、碱基替换3种不同的突变类型,突变效率为53.3%。并且发现CRISPR/Cas9技术确实有脱靶效应的存在。本研究为之后的研究提供了很好的经验,今后在使用该技术时,可以进行多位点敲除,减少脱靶效应。（2）NgAgo-gDNA技术敲除青鳉mep50基因。本研究对NgAgo-gDNA技术进行了改进,以pIRES2-eGFP质粒为载体骨架,插入T7启动子、SV40NLS、核质蛋白NLS、NgAgo、斑马鱼nanos3-3’UTR 等基因序列,构建 pNgAgo-IRES2-eGFP-nos载体。利用NgAgo-gDNA技术同样对青鳉mep50基因进行敲除,选择的靶位点与CRISPR/Cas9技术中的gRNA靶位点位置相同。体外合成NgAgo mRNA,与gDNA按比例混合后设置3个浓度,对青鳉受精卵显微注射,获得F0代胚胎。T7EI酶切检测结果显示,第一外显子序列有突变产生,第二外显子序列无突变产生。测序分析结果表明第一外显子gDNA靶位点处无突变产生,而靶位点上游83 bp处有缺失4 bp的缺失突变,突变效率为10%。为什么突变位点位于目标序列上游尚不明了,该结果还需进一步验证。但是实验结果表明,本研究中所改造的NgAgo-gDNA技术可能可以在青鳉中使用,但是较之CRISPR/Cas9还不成熟,需要进一步摸索探究来完善该技术。（3）筛选prmt5突变体后代。本课题组前期采用TALEN技术进行了prmt5的突变,本研究在前期研究的基础上,进行突变体后代的筛选。F1代共筛选20条性成熟个体,有6条为突变杂合子。测序结果显示,突变类型均为缺失4 bp的移码突变。突变杂合子雌雄两两混合获得F2代,发现F2代胚胎有畸形和白化现象,死亡率高达46.1%。实验组与对照组相比,具有显著性统计学差异（P<0.01）。所有死亡的胚胎中有17.1%是在发育至1～2天就死亡,有可能发生了突变纯合子致死现象。F2代共筛选45条性成熟个体,T7EI酶切法筛选出13条疑是突变纯合子。经测序验证发现,这13条实际应为突变杂合子。这一结果再次说明,F2代有可能出现了突变纯合子致死现象,因而不能获得纯合子后代。今后可对发育至1～2天死亡的胚胎提取基因组DNA,测序验证是否发生纯合突变致死;也可对突变杂合子进行转录组分析,以对prmt5的功能进行研究。总之,本研究初步得到了青鳉prmt5和mep50突变体后代,为研究两者功能关系提供了良好的基础条件。本研究一共涉及到3种不同的基因编辑技术,尤其是对于最新出现的NgAgo-gDNA技术进行改进并试用。结果发现,该项技术还不成熟,需要进一步探究。