随着“人类基因组计划”的完成,对于人类相关疾病的早期准确诊断及治疗研究受到广泛关注,例如：近期发生的H7N9型禽流感的的诊断除流行病学接触史和临床表现,主要是依靠病毒核酸检测;肿瘤细胞的基因检测和药物靶向治疗;禽流感病毒的不同变异型号(HIN1、H3N2、H5N1、H7N7、H7N9及H9N2)疫苗的研制等。大肠杆菌曾作为人类的五种“模式生物”之一,在“人类基因组计划”中研究,肠出血性大肠杆菌感染是一种是一种人畜共患病,它可通过被污染的水、食物,及人际间接触而传播,因此对饮用水中大肠杆菌的监测非常重要,对其快速、高效、简便检测方法的研究有重要意义。基因诊断和基因治疗的首要条件在于对致病基因碱基序列的识别和确定,在种类繁多的基因检测技术中,基于特异性碱基互补原理而构建的DNA生物传感技术,正为许多研究者所重视。目前,电化学DNA检测方法因其价廉、快速、灵敏、特异性、操作简单和方便携带等优点,被研究者认为是最有发展前景的-类DNA分析方法,正受到越来越多的广泛的关注；纳米颗粒和主客体识别技术在电化学DNA生物传感器中的运用,及均相杂交体系的高杂交效率,均使得这种新型传感技术的研究具有吸引力。本论文的主要创新之处是将纳米技术和主客体识别技术相互融合构建了非固定化新型电化学DNA生物传感器。同时,基于生物分子之间的竞争替代作用并与电化学分析技术相结合,构建了用于定量检测凝血酶蛋白的电化学传感器。这两种传感器均具有高特异性和高灵敏度,能够成功应用于对特定序列DNA片断的选择性测定,及对目标蛋白的特异性识别和定量检测,为基因及蛋白质的分析测定提供了一种简便、高效、廉价的新理念。第一章绪论这一章首先系统介绍了电化学DNA生物传感器的研究进展。主要介绍电化学DNA生物传感器的原理及其两大关键问题(探针DNA在电极表面的固定化和DNA杂交反应的不同电化学指示剂),并举例叙述了其在基因检测等方面的应用。随后,介绍了核酸适配体生物传感器的概况及主客体识别技术在生物传感器中的应用。最后阐述了本论文的目的和意义,指出论文的创新之处及主要研究内容。第二章基于主客体识别技术构建电化学适体传感器检测凝血酶本章介绍了基于目标蛋白与其核酸适配体替代机制和主客体分子识别术构建的一种灵敏的用于检测凝血酶的电化学适体传感器。该传感器设计了一种新颖的双标记凝血酶适体(TBA)探针,该探针的3’端标记巯基,5’端标记4-4-二甲氨基苯基偶氮苯甲酸(Dabcyl)。探针通过Au-S自组装于金电极表面,而表面修饰了β-环糊精的CdS纳米颗粒(CdS-CDs)则被用于指示电化学信号,并通过CDs和dabcyl之间主客体识别过程连接到TBA探针修饰的电极上无凝血酶存在时,探针末端Dabcyl与CdS-CDs发生主客体识别并保持线性结构。有凝血酶存在时,凝血酶与电极表面的适体分子结合形成G-四分体结构,使得CdS-CDs脱离电极表面进入溶液。并且,溶液中CdS纳米颗粒的电化学响应信号与目标蛋白浓度成正比。这种方法操作简单,可是凝血酶的检测限低至4.6×10-12M。第三章基于生物素/亲和素和酶放大构建的均相杂交DNA电化学传感技术本章介绍了基于生物素(Biotin)一亲和素(Avidin)系统(BAS)构建的一种均相溶液杂交的酶放大型电化学DNA检测的新方法。这种方法的关键是设计了一种新颖的茎环结构的双标记多组分金纳米DNA探针(MCP),它是由发夹DNA(探针DNA)、辣根过氧化酶(HRP,酶催化放大)和牛血清白蛋白(BSA,非特异性封闭剂)共同组装在16nm的金纳米颗粒表面而成。该发卡DNA探针3’端标记biotin分子,5’端标记巯基(-SH)。同时采用avidin修饰的金电极捕获MCP上标记的biotin分子。杂交反应发生前,探针保持茎环结构,迫使biotin分子靠近金纳米颗粒。由于空间立体效应,阻碍了biotin与电极表面avidin的相互作用,导致MCP不能被电极捕获。与目标DNA均相杂交后,形成双链的DNA,MCP的茎环结构展开,使得biotin分子易于与电极表面修饰的avidin发生特异性反应,进而被电极捕获。由于捕获的MCP上标记的HRP不能直接有效地进行电子传递,引入了硫堇(Thionine, TH)作为HRP酶催化还原过氧化物H202的电子媒介,酶催化还原电流信号可用于目标DNA的定量分析。在最佳条件下,捕获效率与目标DNA浓度成正比,检测限可低至1pM,且对单碱基错配有很好的区分能力。该方法灵敏度高、特异性好,可以预见这种电化学传感技术在核酸检测和疾病诊断等方面具有很好的应用前景。