研究背景与研究目的非霍奇金淋巴瘤是血液系统的恶性肿瘤,在世界范围内高发。每年新增病例约385000余例,死亡人数约199630。非霍奇金淋巴瘤在男女发病比例中分列第8位和第11位,占肿瘤年发病率的5.1%,肿瘤死亡率的2.7%。根据国际癌症研究机构公布的GLOBOCAN2012年的数据,该疾病是发达国家中死亡的首要原因,发展中国家第二重要的原因。2012年世界范围内约8.3万人死亡。非霍奇金淋巴瘤在发达国家发病率较高,在发展中国家,恶性非霍奇金淋巴瘤的发病率有逐年增高的趋势,如泰国及中国。非霍奇金淋巴瘤中80%为B细胞表型,剩余为T细胞表型。CD20分子是细胞膜表面标志物,B细胞分化抗原。主要表达于前B细胞,成熟B细胞及多数恶性B淋巴细胞表面,而在造血干细胞、浆细胞和其他正常组织表面并不表达。CD20分子是治疗B细胞淋巴瘤的理想靶标。因为CD20分子在细胞膜上比较暴露,且在B淋巴细胞表面表达水平较高,这使得利妥昔或者奥法木此类单克隆抗体比较容易接近并结合,同时,CD20分子与单克隆抗体结合后,没有显著的内吞及脱落现象。这使得单克隆抗体可以长时间存在于细胞膜表面,长期提供由补体及FCR表达引起的持续性免疫攻击,特别是来自巨噬细胞的免疫效应。CD20分子与单克隆抗体结合后也可以产生跨膜信号,虽然未经证实,这可能提供抗CD20单克隆抗体的治疗成功的重要原因。这些特点使抗CD20抗体被开发用于免疫治疗,通过杀死正常或者恶性B细胞,在治疗自身免疫性疾病和恶性肿瘤方面取得了显著效果。以往的研究表明,抗CD20抗体可能涉及多种机制提供的治疗效果,包括补体依赖细胞毒作用(CDC),抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)以及诱导细胞凋亡。这些引起抗肿瘤效应的不同的作用机制目前仍不明确,依然是问题的论点。基于CD20脂筏重新分配功能,抗CD20单克隆抗体可以简单地分为两类：Ⅰ型单克隆抗体(利妥昔单抗和大多数抗CD20抗体),此类单克隆抗体能够有效地将CD20分子复合物转脂筏介导CDC效应,但不能诱导细胞凋亡,Ⅱ型单克隆抗体(如B1),此类单克隆抗体不能促进CD20分子转脂筏,也不能诱导CDC效应,而是更有效地诱导细胞凋亡。这两种类型的单克隆抗体均可以介导ADCC效应及FCR段介导的粒细胞效应。抗CD20单克隆抗体在治疗自身免疫疾病和恶性肿瘤中取得的成就使得单抗治疗成为新的研究热点。到目前为止,超过十种单克隆抗体已经通过美国食品和药物管理局(FDA)批准上市,Rituximab(美国IDEC生产C2B8)是以B细胞表面标志物CD20分子为靶点,第一个经美国FDA批准用于治疗复发或者难治性或者滤泡B细胞非霍奇金淋巴瘤的单克隆抗体。利妥昔单抗的成功鼓励我们进一步改进现有的或者寻找新的抗CD20抗体。尽管利妥昔单抗治疗B细胞淋巴瘤临床效果比较显著,仍有48%的病人对Rituximab的治疗完全反应率低于10%。因此,为满足临床的提高药效,增加单抗应用范围的要求,寻求更为有效的抗CD20抗体治疗显得尤为迫切。在本文中,我们将着重讨论抗CD20单克隆抗体的杀伤机制。这些单克隆抗体,尤其是通过对Ⅱ型抗CD20单克隆抗体抗肿瘤机制研究,驱动免疫治疗,导致细胞死亡的研究机制讨论其可能的作用方式,为以后抗体的进一步提高和开发提供思路。研究方法1)利用流式细胞仪技术(Flow cytometry),使用细胞死亡染料对细胞进行染色,体外鉴定细胞死亡,观察不同抗体不同浓度情况下引起的细胞死亡状况。并利用透射电镜技术(TEM, Transmission electron microscope)观察不同抗体处理后,细胞的死亡形态,鉴定其死亡形式。2)借助western-blot,检测细胞死亡通路的关键蛋白,确定或排除其诱导细胞死亡的信号通路。并通过荧光免疫共聚焦显微镜技术(Confocal immunofluorescence)观察细胞各蛋白释放情况,并通过其对应的抑制剂作用确定该蛋白与细胞死亡的相关性。3)运用免疫共沉淀(Co-IP)的方法,鉴定与CD20分子相关的蛋白,并运用银染的方法分析CD20复合物中的蛋白,再利用western-blot的技术进行鉴定。同时利用其阻断剂对其信号进行阻断,观察其作用,能否引起细胞死亡。并使用慢病毒干扰体系对细胞系进行体外干扰,使该蛋白低表达,使用流式细胞技术检测其功能,验证还能否引起细胞死亡。4)从下游通路向上反推,筛选起作用的抑制剂以确定上游信号通路。并运用荧光免疫共聚焦显微镜技术(Confocal immunofluorescence)检测其蛋白释放状况,并通过抑制剂作用后再次验证。实验结果：1)Ⅱ型抗CD20抗体引起的细胞死亡并非凋亡,而是坏死：我们使用Ⅰ型抗CD20抗体Rituximab作为对照,Ⅱ型抗CD20抗体11B8以及此前研究中得到的突变型抗体HY102K为研究对象,发现Ⅱ型抗CD20抗体引起的细胞死亡并不是凋亡,而是一种坏死。且即使在交联情况下,Ⅱ型抗CD20抗体诱导细胞死亡能力也明显强于Ⅰ型抗CD20抗体,这种细胞死亡是浓度依赖的。2)这种细胞死亡是非Caspase依赖的,而是溶酶体依赖的细胞死亡：通过westen-blot的检测,我们发现Ⅱ型抗CD20抗体引起的细胞死亡是一种非Caspase依赖的细胞死亡。通过荧光免疫共聚焦显微镜技术(Confocal immunofluorescence)检测,我们发现,这种细胞死亡是溶酶体依赖(lysosome-dependent)的细胞死亡。溶酶体破裂后释放CathepsinB,这种细胞死亡可以被CathepsinB抑制剂所抑制。3)CD20分子与TNFR共同作用,激活下游通路：通过免疫共沉淀(Co-IP)的方法我们发现CD20相关复合物含有多种蛋白,应用银染和westen-blot的方法,我们鉴定出TNFR与CD20分子天然结合,并共同激活信号通路,引起下游信号通路变化。我们初步认定这种细胞死亡是程序可控性坏死。运用其抑制剂necrosis可以显著抑制细胞死亡。TNFR的阻断剂同时也可以对抗体引起的细胞死亡有抑制作用。我们运用免疫共沉淀(Co-IP)发现了多种程序性坏死信号通路上的相关蛋白,并应用westen-blot技术观察到了RIP1,RIP3的结合变化。认为只有Ⅱ型抗CD20抗体与CD20分子结合后可以激活程序性坏死(necroptosis)通路。运用慢病毒系统低表达RIP1后可以观察到程序性坏死被抑制。4) Ceramide引起下游通路变化：已知细胞死亡是由溶酶体破裂,释放CathepsinB后引起细胞死亡,通过大量抑制剂筛查,并通过流式检测细胞死亡情况得知CE内化后,FADS7激活sphingolipid-delta-4-desaturase(DES1),使D-erythro-sphinganie转变为Derythro-sphingosine(鞘氨醇),结合于蛋白酶C端,之后引起溶酶体破裂,释放CathepsinB,最终诱导细胞死亡。并通过荧光免疫共聚焦显微镜技术进行了验证。结论我们发现Ⅱ型抗CD20抗体引起的细胞死亡是一种程序可控型坏死而不是凋亡。这种细胞死亡为非Caspase依赖的,溶酶体依赖的细胞死亡。Ⅱ型抗CD20抗体与CD20分子结合后通过与TNFR协同作用引起下游信号通路变化,诱导细胞死亡。在下游通路上,我们得出的结果说明,神经酰胺在Ⅱ型抗CD20抗体的刺激下内化,FADS7泛素化降解激活sphingolipid-delta-4-desaturase,使D-erythro-sphinganie转变为Derythro-sphgosine,结合于组织蛋白酶特定的C区并激活,之后引起溶酶体破裂,释放CathepsinB,最终诱导细胞死亡。本文详细说明了Ⅱ型抗CD20抗体杀伤肿瘤细胞的作用机制,并首次提出了CD20与TNFR共同传导信号的模型,为临床应用Ⅱ型抗CD20抗体治疗淋巴瘤提供了理论依据,解释了其信号传导通路。希望能为今后设计更好的治疗淋巴瘤的抗体药物和设计更合适的联合用药方法提供思路。