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胃癌是一个全球性的患者多发的癌症之一,其发病率居癌症中的第五位,死亡率居第三位,且在东亚地区发病率最高。胃癌具有高频体细胞拷贝数变异（somatic copy number variation,SCNV）和高度基因组不稳定性（genomic instability,GIS）,且原发于空腔脏器,易发生腹膜转移,导致难以通过现有影像学评价标准准确评估药物治疗的疗效,亟待探索更有效的疗效评估手段。虽说近年来随着药物的治疗,胃癌患者的平均五年生存率有所提高,但是相对而言,胃癌病人的预后仍然偏差。因此,对于寻找治疗胃癌患者的靶标尤为重要和迫切。泛素化修饰是维持正常细胞生命进展的关键,近年来有许多E3泛素连接酶在肿瘤中的作用被广泛报道,作为肿瘤治疗的潜在靶点被高度关注。HECTD3（Homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3）是HECT E3泛素连接酶家族的成员,据报道HECTD3在乳腺癌,卵巢癌和人食管鳞癌中高表达,并参与细胞凋亡和免疫调节,促进了癌细胞的增殖和转移。但是对于HECTD3在其它肿瘤中的作用和机制的认识尚不全面,尤其是HECTD3在胃癌中的作用和机制尚不清楚。所以本文旨在探究HECTD3在胃癌中的作用机制。1.HECTD3在胃癌细胞中高表达且患者预后差为了探索HECTD3在胃癌中的作用。我们首先通过胃癌数据库分析了HECTD3在胃癌患者中的预后情况,结果显示HECTD3高表达,胃癌患者预后差。为了更近一步探究HECTD3的表达情况,我们运用Western blot实验和荧光定量PCR检测了HECTD3在正常胃腺细胞GES-1和胃癌细胞SGC7901、MKN45、HGC27、MGC803中的蛋白和m RNA的表达情况,研究结果显示HECTD3在胃癌细胞中高表达,这些研究结果表明HECTD3在胃癌中扮演着癌基因的角色,可能成为治疗胃癌患者有前景的靶标和标志物。2.HECTD3调控胃癌细胞的增殖和细胞周期为了探究HECTD3对胃癌细胞增殖和周期的影响,我们构建了针对HECTD3下调的干扰质粒shHECTD3和过表达HECTD3的质粒。针对胃癌细胞SGC7901和MKN45,我们下调了HECTD3的表达,并通过MTT实验、BrdU实验检测了下调HECTD3对胃癌细胞增殖情况的影响,结果显示下调HECTD3的表达能够抑制胃癌细胞的增殖。为了更进一步的进行探究,我们运用流式细胞仪和Western blot实验检测了下调HECTD3后对胃癌细胞周期阻滞情况和相关周期蛋白的表达情况的影响。实验结果显示,下调HECTD3的表达后,胃癌细胞的增殖受到显著抑制,细胞周期阻滞在G1/S期,相关周期蛋白CDK2和CDK4的表达下调。之后,为了验证下调HECTD3对胃癌细胞增殖的影响不是由于脱靶效应引起的,我们对下调了HECTD3的胃癌细胞进行了恢复实验,并通过MTT实验,BrdU实验,流式细胞仪检测恢复HECTD3后对胃癌细胞的增殖情况和周期阻滞情况的影响。结果显示下调HECTD3恢复后,其细胞增殖抑制情况得到挽救,细胞周期阻滞情况得以解除。这些实验结果表明HECTD3在胃癌中作为一个癌基因的角色,为胃癌患者的治疗提供了一定的理论依据。3.HECTD3抑制胃癌细胞的凋亡为了探究HECTD3对胃癌细胞迁移和凋亡的影响,我们运用了Transwell实验检测下调HECTD3对胃癌细胞迁移能力的影响,结果显示,下调HECTD3能够抑制胃癌细胞的迁移能力。接着,我们运用流式细胞仪和Western blot实验,检测了下调HECTD3后对细胞的凋亡和相关凋亡蛋白表达的影响。研究显示,在胃癌细胞SGC7901和MKN45中下调HECTD3后,胃癌细胞凋亡显著。相关凋亡蛋白的表达和流式细胞仪检测凋亡分析结果一致,c-PARP和P53的表达上调。而在胃癌细胞中下调HECTD3对其进行恢复实验后,流式细胞仪分析显示细胞凋亡减少,Western blot实验检测到c-PARP的表达下调。这些实验结果说明了HECTD3能够促进胃癌细胞的迁移能力并且通过抑制细胞凋亡发挥促癌基因的作用。4.HECTD3促进胃癌细胞体外克隆和小鼠体内成瘤能力基于上述实验结果,我们又探究了HECTD3对胃癌细胞体外克隆形成能力和小鼠体内成瘤能力的影响。我们通过soft arga实验和小鼠皮下成瘤实验检测下调HECTD3后对体外克隆形成能力和小鼠体内成瘤能力的影响,soft arga实验结果表明下调HECTD3后,胃癌细胞克隆数显著下降,而下调HECTD3对其进行挽救实验后,体外克隆数有所恢复。同样的,小鼠皮下成瘤实验表明,下调了HECTD3后小鼠体内肿瘤重量和大小显著低于对照组,并且挽救HECTD3的表达后,肿瘤体积和重量得到恢复。最后对小鼠肿瘤进行免疫组化实验检测HECTD3和增殖标记物Ki67在肿瘤中的表达情况。免疫组化检测结果发现Ki67和HECTD3在实验组中的表达少于对照组,并在恢复HECTD3表达后Ki67和HECTD3的表达都有所恢复。以上实验结果说明了HECTD3能够促进胃癌细胞的体外克隆能力和小鼠体内成瘤能力。综上所述,我们首次探索了HECTD3在胃癌中的作用机制,HECTD3在胃癌细胞中高表达,且与胃癌患者预后相关,HECTD3能调控细胞周期,促进胃癌细胞的增殖。此外,HECTD3能显著抑制胃癌细胞的凋亡,并提升胃癌细胞体外和体内成瘤能力。这将为胃癌患者的治疗以及临床研究提供了一定的理论基础,HECTD3可能成为胃癌检测和治疗的一个重要靶点。