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利用肝素酶I制备低分子量肝素条件温和,反应高效,专一性强,并且降解过程不会导致硫酸根基团的丢失,因此在低分子量肝素的生产中具有巨大的潜力。然而目前用于制备低分子量肝素的肝素酶I稳定性差,在25 ℃下半衰期仅200分钟,稳定性无法满足工业生产的要求。本论文尝试利用辅助分子设计计算,进一步通过结构改造提高肝素酶I的热稳定性。论文的主要内容包括两部分:第一部分通过分析肝素酶I的结构,通过优化得到合理的肝素酶I构象。主要对肝素酶I的α螺旋偶极矩,潜在的二硫键形成位点,以及氨基酸柔性计算,确定了可能影响肝素酶I稳定性的关键氨基酸残基。在对肝素酶I的α螺旋偶极矩的计算中,通过在C端引入带正电荷的氨基酸,在N端引入带负电的氨基酸增加α螺旋的偶极矩从而提高肝素酶I的稳定性。得到了6个突变体:V168E/T177H,V168Glu/T177Arg,V168E/T177K,V168D/T177H,V168D/T177R和V168D/T177K,其中V168E/T177H和V168D/T177R突变体保留27.7%和30.3%的催化活力,且25 ℃半衰期为野生型的15.48%和14.14%,其余突变体在突变后丧失催化活力。通过Disulfide by Design在线服务器对肝素酶I潜在二硫键形成位点进行计算,结果显示S57C/A365C,I106C/L172C,T109C/H112C和W147C/L226C的突变可能形成二硫键,并影响肝素酶I的稳定性。实验结果证明,二硫键的引入会导致肝素酶I表达受阻。最后对肝素酶I柔性氨基酸的计算中发现,Ala145是肝素酶I中最不稳定的氨基酸残基,对其进行饱和突变,研究该点柔性对肝素酶I稳定性的影响。实验显示Ala145突变为异亮氨酸（Ile）,亮氨酸（Leu）,甲硫氨酸（Met）和缬氨酸（Val）后,柔性降低,且突变后保留了7%,10%,2%和21%的催化活性,而25 ℃下的半衰期为430,380,250和360分钟,相对于野生型肝素酶I的200分钟均有不同程度的提高。第二部分采用两种不同的计算工具计算肝素酶I和突变体的解折叠自由能的差值（ΔΔG）,筛选可能影响肝素酶I稳定性的位点。首先采用Prethermut软件预测肝素酶I单点突变后的解解折叠自由能,并根据其与野生型的差值筛选出以下四个突变体:W33P,F60Y,E82N和D152I。结果显示,仅突变体D152I保留40%,其25 ℃的半衰期为1300分钟,相较于野生型提高了7.5倍,其余突变体则在突变后丧失催化活性。继续通过Fold X结合Rosetta软件预测肝素酶I单点突变后的解折叠自由能,并筛选出如下17个突变体:K14E,F48Y,R63K,G73A,S141V,T142I,Q157M,A190I,K213G,N240F,R244K,S256M,S272Y,T300L,N307T,Q338L和D344E。而在以上17突变体,除了K14E,F48Y,R63K,T142I,N240F,T300L和Q338L丧失催化活性外,其余突变体不仅保留较高的催化活性,而且其25 ℃的半衰期也有大幅度的提高。其中以G73A和K213G最为突出,其催化活性位野生型的91.77%和75.69%,而25 ℃的半衰期为14000和8700分钟。通过计算选择性突变,有效提高了肝素酶I的热稳定性同时保持了其催化活性,为肝素酶I的工业应用奠定了一定的基础。此外,本论文设计的热稳定性改造策略,也可以为其它酶的结构改造提供一定的借鉴意义。