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真核生物的染色体紧密排列在细胞核内,且它们在细胞核内都有各自的特定区域。染色体的时空结构由严格的层级结构组成,包括染色体区域,拓扑相关域和染色质环,它们在调节基因表达中发挥着重要的作用。然而,目前尚不清楚染色体的结构和动力学是如何调节转录、复制和DNA修复等一系列过程。因此,若在活细胞中实现染色体动态的可视化,则它会在揭示染色体如何动态控制基因组功能方面起到关键性作用,但目前的技术不足以让我们追踪感兴趣的任意基因组位点。尽管利用CRISPR基因组成像技术可以部分实现基因组位点的可视化,但仍存在局限性:一是信噪比低,二是难以实现非重复序列的可视化,三是无法实现任意基因组位点的可视化。因此,我们对此开展了一部分工作。针对信噪比低的特性,本课题在第一章利用最亮的荧光蛋白mNeonGreen与dCas9-SunTag系统结合,建立了高信噪比和高效标记系统,与之前的研究相比,在标记重复序列和低重复序列方面实现了高信噪比,并且能够长时间观察端粒运动,探究了端粒运动和细胞核动态变化的相关性,为实现基因组三维结构的可视化奠定了基础。本课题第二章在基于第一章所构建的系统上引入了更多的Cas9突变体用于活细胞标记,包括 dCas9、devoCas9、dxCas9、deCas9 和 dCas9-HF1,结果显示它们均可标记重复序列和低重复序列。通过比较它们的标记效率和含有目的基因荧光点的细胞比例发现,dCas9在活细胞基因组成像上表现最佳,dxCas9最差。更进一步地,我们构建了观察Tet启动子动态变化的系统,即在MCF-7细胞株的 ACTB 位点上敲入 CRISPRTag-Tet-H2B-mCherry-P2A-puro-24XMS2,观察Tet启动子在转录前后所发生的动态转变,利用MS2适配体观察此系统的RNA转录状态,实现了基因组三维结构中部分组成元件的可视化。将特定基因位点的DNA和RNA同时成像可以用于研究细胞如何实现不同事件之间的时间协调,即从DNA复制到转录再到mRNA加工修饰、翻译和衰变,为揭示基因组三维结构在时空上是如何控制基因表达提供了平台。