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据2008年世界卫生组织(WHO)统计公告,截止到2004年,缺血性心脏病和脑血管疾病分别位列全球死亡人数的前两位,共占死亡人数的21.9%,并且预计到2030年,这个比例将达到26.3%。进入本世纪以来,随着人民生活水平的提高,心脑血管疾病已成为我国的第一位杀手。缺血性心脏病和脑血管疾病都是由于动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)而导致动脉梗阻或狭窄,并且大部分人没有前驱症状,现有的诊断技术难以在心脑血管事件发生前检测出来。导致急性心脑血管疾病发生的主要原因是AS斑块破裂和血栓形成,而70%-80%的冠状动脉血栓形成继发于斑块破裂,易损斑块是AS斑块破裂和血栓形成的直接原因。因此,深入研究易损斑块的发生机制对降低AS疾病的致残、致死率有至关重要的意义。
研究报道斑块破裂主要发生在斑块近心端的高切应力区域,但是其机理一直没能阐明。而斑块内血管新生,特别是未成熟的新生血管(未形成完整稳定的中膜和外膜)可能是引发斑块内出血导致易损斑块形成的重要因素。切应力和氧化型低密度脂蛋白不仅是AS易损斑块形成的重要刺激因素,也是血管新生的重要调节因素,如能阐明狭窄血管近心端的高切应力通过刺激内皮细胞血管新生进而引起易损斑块形成及其分子机制,特别是分化抑制因子(Inhibitor of Differentiation,Id1)信号通路参与血管新生的地位和作用,不仅能为AS易损斑块的成因理论提供科学依据,而且能为易损斑块治疗提供新的靶点。
在本课题研究中,我们用血管外周套环在兔左颈总动脉上构建狭窄模型,并使用血流量计测量血流量并计算狭窄血管近心端和远心端的切应力。在此基础上给兔子饲喂高脂饲料(1%胆固醇和5%猪油),进而研究斑块的组成、血管新生种类、数量以及切应力和氧化型低密度脂蛋白(Oxidized Low Density Lipoprotein,oxLDL)对血管新生的影响和Id1表达和分布的调控。并进一步通过构建Id1过表达和干扰稳定细胞株来研究Id1调控血管新生的分子机制。主要研究内容和结论如下:
1.构建兔左颈动脉狭窄模型,右侧颈动脉进行假手术对照,用血流量测量计算显示狭窄血管近心端为高切应力区域,而狭窄血管远心端为低切应力区域。在普通饮食条件下,仅缩窄性套环模型不会引起易损斑块的形成,高切应力和低切应力区域引起的内膜增生基本一致。但高脂饮食情况下,左颈动脉狭窄血管近心端易发生易损斑块,远心端仅引起内膜增生。而右侧对照血管,虽然也暴露在于高脂条件下,但仅有极其轻微的内膜增生。与低切应力区域相比,高切应力区域斑块内出血显著增加(83%比17%,p<0.01),胶原含量下降(10.6%±0.5%比33.1%±1.2%,p<0.01),高切应力区域平滑肌细胞凋亡增加(7.03±2.22比1.87±0.49,p<0.05)。有意思的是,与低切应力区域相比,高切应力虽然诱导易损斑块形成,但内皮层完整并且功能正常,具有高的一氧化氮合成酶表达(1570.33±345.54比172.98±49.89,p<0.01)。
2.通过对兔子狭窄血管远心端组织进行HE染色和透射电镜研究显示,与远心端低切应力区域相比,狭窄血管近心端高切应力区域有大量的新生血管(20±3n/mm2比4±1n/mm2,p<0.01),并且对新生血管的超微结构研究发现高切应力区域易损斑块内的新生血管主要为外膜不完整、内皮细胞有凋亡趋势、管腔内有大量淋巴细胞浸润的易泄漏微血管。为了进一步证明高脂饮食条件下,高切应力区域有更多的血管新生,我们通过动脉环血管生成模型研究,在高脂饮食情况下,左颈动脉狭窄血管近心端的血管新生能力最强,其次为狭窄血管远心端,都比同一大鼠右侧未狭窄血管的血管新生能力要强。以上结果显示高切应力和脂蛋白可能都是血管新生的重要调控因素。
3.通过体外构建流动腔系统来研究切应力对内皮细胞血管新生以及Id1蛋白的表达和分布调控。结果显示高切应力促进Id1蛋白的表达和出核,同时促进血管新生。另外,我们也研究了oxLDL对内皮细胞血管新生的调控以及Id1蛋白的表达和分布。结果显示低浓度的氧化型低密度脂蛋白促进血管新生和Id1蛋白的表达和出核,而当Id1蛋白出核被抑制后,oxLDL促进内皮细胞血管新生的能力明显得到抑制。
4.在发现Id1蛋白是高切应力和低浓度的氧化型低密度脂蛋白调控血管新生重要蛋白的基础上,我们进一步通过构建Id1过表达和干扰载体来研究Id1调控血管新生的分子机制。上调脐静脉内皮细胞Id1的表达激活内皮细胞整合素β1的表达,并促进细胞的粘附和铺展;相反,抑制细胞内Id1的表达抑制了整合素β1的表达,并且抑制内皮细胞粘附、铺展以及血管新生等。通过使用整合素β1抗体发现Id1调控内皮细胞的粘附、铺展和血管新生受整合素β1的调控。此外,我们进一步分析内皮细胞的细胞骨架,上调人脐静脉内皮细胞内Id1的表达后,内皮细胞的骨架形成能力和细胞收缩能力均增强,而干扰Id1后完全抑制了胞浆内细胞骨架的形成,并且通过使用Rho激酶抑制剂Y27632能够抑制Id1过表达增强的细胞骨架和血管新生。
5.Id1能够促进血管新生和整合素β1的表达,但是Id1调控整合素β1表达的机制还没有被阐明。过表达Id1促进细胞迁移和整合素β1的表达,但是抑制整合素β1阻断细胞的迁移,Id1过表达引起的细胞迁移也可以被整合素β1抗体抑制,这暗示Id1促进细胞迁移是通过调控整合素β1来实现的。Id1抑制p53表达,并抑制p53入核。为了证实p53确实能调控整合素β1的表达,我们使用p53特异性的功能抑制剂Pifithrin-α(PFT-α),对p53本身的表达和分布没有明显的影响,而PFT-α可以逆转Id1敲除所抑制的内皮细胞迁移和整合素β1的表达。从而证实Id1-p53信号通路通过调控整合素β1的表达介导内皮细胞的迁移和血管新生。
综上所述,通过本研究工作我们阐明了切应力和氧化型低密度脂蛋白调控血管新生的调控过程,可能为斑块破裂发生在斑块侵入内腔后引起的斑块内狭窄近心端的高切应力区域提供证据。我们的结果为动脉粥样硬化斑块破裂发生在高切应力区域提供新的科学依据,为抑制动脉粥样硬化病理性血管新生提供新的靶点。