血管性血友病因子裂解酶（vWF-cp／ADAMTS13）是新近发现的一种血浆金属蛋白酶，它主要水解大分子量的血管性血友病因子（vWF）多聚体成小分子的肽段。vWF是人体内止血与血栓形成中的主要糖蛋白之一，vWF多聚体的大小与其功能密切相关，它的分子量越大，则与胶原和血小板的结合能力越强。因此，vWF-cp可以通过对vWF多聚体大小的调控来调节vWF多聚体与内皮下胶原和血小板的粘附能力，从而影响血栓的形成。vWF-cp活性的缺乏导致血浆中超大分子量的vWF多聚体（UL-vWF）出现并在微血管内聚积，引发血栓性血小板减少性紫癜（TTP）。此外，动脉血栓性疾病、恶性肿瘤以及肝脏疾病等均伴有vWF含量的增高，但其原因尚不清楚，而且在上述疾病中多伴有vWF-cp活性水平的下降。本研究克隆和表达了vWF-cp的金属蛋白酶域，以此为抗原制备了该酶的单克隆抗体，为vWF-cp抗原水平的检测及其结构与功能的研究奠定了基础；同时，还了解了vWF-cp在血栓性疾病与肿瘤患者中表达的改变，探索了该酶在上述疾病发病中的作用和临床意义。 一 vWF-cp的表达及其单克隆抗体的制备 血浆中vWF-cp蛋白的氨基端为金属蛋白酶域，该结构域内含有一段与蛇毒金属蛋白酶活性中心一致的氨基酸序列，其中的三个组氨酸与Zn²⁺构成该酶的活性区，可能是直接降解vWF多聚体的部位。所以，该结构域对vWF-cp降解其底物极为重要。 我们根据GenBank中vWF-cp cDNA序列设计引物，应用聚合酶链反应（PCR）从含vWF-cp cDNA质粒中扩增出该酶的活性域，克隆至pUC18载体后行序列分析，并将其重组于带有6×His Tag的融合蛋白表达载体pET28a（+）中，在大肠杆菌DE3／plySs中诱导表达。重组蛋白经Ni-NTA柱纯化后，采用蛋白印迹（Western blot）鉴定。结果显示，PCR扩增得到658bp的vWF-cp金属蛋白酶域基因片段，测序结果与GenBank序列一致。重组表达质粒pET28a（+）-vWF-cp／MD经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导后表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在，占菌体总蛋白的28％。Western blot结果显示，重组蛋白能够特异地与抗His Tag的单抗Penta-His反应。将纯化的重组蛋白免疫Bal b／c小鼠，取脾细胞与SP2／0细胞融合，筛选获得三株稳定分泌抗vWF-cp活性域单抗的细胞株，两次单克隆后，收集细胞接种于小鼠腹腔产生腹水。对其中两株单抗SZ-112和SZ-113的进一步鉴定结果显示，它们均属血管性血友病因子裂解醉单克隆抗体的制备及该醉与血栓和肿右发病的关系中文摘要IgG:亚类，腹水中的含量约为4m创d，效价达1 x 10-5，而且识别v认T一金属蛋白酶域不同的表位。从触滋em blot证实这两株单抗能够识别还原及非还原条件下的重组蛋白。免疫沉淀和W七引哈m blot结果显示，两株单抗能够识别正常人血小板裂解液中200 KDa的蛋白;进一步用流式细胞术鉴定单抗，发现它们能够与经穿膜处理的血小板结合，但不与经穿膜处理的白细胞、红细胞以及未经穿膜处理的血小板结合。上述结果表明，我们应用重组蛋白制备出一组针对v场T却活性域的单抗，其中两株单抗的抗原识别位点不同，为我们利用单抗研究vWF一金属蛋白酶域的功能以及建立检测血浆vWF一cP抗原水平的方法奠定了基础。 另外，利用所制备的单抗结合免疫组化分析了各种正常组织中vWF一p蛋白的表达情况，证实了vWF一p仅在细胞胞质中表达，而在细胞膜表面和细胞核中不存在。在甲状腺、肺、肾脏、小肠、前列腺内vWF一cP主要局限在各组织的上皮细胞中，而在正常肝、脾、胸腺的组织细胞中有表达，脑组织中未见表达。 同时，我们采用PCR一SOE（PCR一重叠延伸技术）结合酶切的方法构建了含有vWF一cP cDNA全长4284bP的真核表达质粒peDNA3.1一v认T.cp，经PCR扩增、酶切鉴定及测序分析，均证实了克隆的vWF一cP cDNA序列的正确性.通过脂质体介导将PcDNA3 .1一vWF一cP质粒转染CHO细胞，Westem blot分析转染后的CHO细胞培养上清和细胞裂解液中vWF一cP的表达情况，发现均存在该酶的表达。这将有助于我们建立该酶稳定表达细胞株，制备重组人vWF仰用于丁即的治疗。二血栓性疾病患者v、vF一水平的改变及v、vF一基因C1423T多态性的研究 vWF是介导血小板与内皮下组织粘附并进而形成血栓的主要分子，其中大分子量的多聚体作用更强。因此，vWF一cP活性的降低可能会促使血管内富血小板血栓的形成。近来己明确，存在先天性的vWI、cP基因缺陷或在血浆中产生针对该酶的自身抗体，导致血浆中出现uL*wF是TTp致病的原因之一。一些vWF一印的基因突变和多态性在家族性了即患者中被确定，C1423T多态性是目前报道的唯一可能与vWF却活性有关的多态性。该多态性使v认T一蛋白中475位脯氨酸被丝氨酸取代 （P475s）。在发现C 1423T多态性的家系中，携带T等位基因的两个成员均为1423C汀杂合子，其血浆vWF一p活性显著降低。体外定点诱变也证实它影响vWF却的活性。 本研究中我们分别检测了52例急性脑梗死（赶S）、22例急性心肌梗死（AMI）患者和47例年龄与之相匹配的健康对照血浆vWF抗原水平（vWF:Ag）、血型、vWF血管性血友病因子裂解醉单克隆抗体的制备及该醉与血栓和肿亩发病的关系中文摘要胶原结合活