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目的:通过生物信息学方法分析骨肉瘤组织与临近正常组织中长链非编码RNA LINC01116、miR-520a-3p与IL6R的表达水平,推测三者在IncRNA-miRNA-mRNA调节轴中的相关性与相关的信号通路。在此基础上,我们进一步检测LINC01116、miR-520a-3p及IL6R在骨肉瘤组织及骨肉瘤细胞系中的表达水平,并分析其在骨肉瘤细胞生物学行为中的作用,阐明LINC01116对miR-520a-3p及IL6R调节的分子机制,揭示其在骨肉瘤疾病发生发展中的作用。方法:从公共数据库GEO中下载骨肉瘤芯片GSE16089,采用生物信息学分析其中差异表达的mRNA与IncRNA,并通过基因富集分析发现与LINC01116相关表达失调的信号通路。采用Pearson相关性分析探寻差异表达的mRNA和IncRNA组成的相关网络,探讨LINC01116及IL6R差异表达情况及相关性,并利用韦恩图获取能够同时靶向差异表达的LINC01116及IL6R的miRNAs。通过Kaplan-Meier生存分析,选取与患者生存期密切相关的miR-520a-3p,并经Targetscan与miRanda判断其是否能够同时靶向LINC01116和IL6R,并通过双荧光报告系统进行验证。从吉林大学中日联谊医院的手术患者获取切除的3对骨肉瘤及瘤旁正常组织,并培养骨肉瘤细胞系MG-63,U-20S与Saos-2和人正常成骨细胞系hFOB 1.19,采用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)对芯片分析结果进行验证,并对获取的骨肉瘤组织与骨肉瘤细胞系中LINC01116、miR-520a-3p及IL6R的表达水平进行检测。LINC01116、miR-520a-3p及IL6R表达水平对骨肉瘤活性、迁移与凋亡的影响通过MTT实验、Transwell实验与流式细胞仪评估骨肉瘤细胞进行评估。采用Western blot检测IL6R蛋白在骨肉瘤组织及骨肉瘤细胞系中的表达水平,检测JAK-STAT信号通路相关蛋白磷酸化水平。在裸鼠上建立骨肉瘤荷瘤模型,通过动物实验评估LINC01116在体内的作用。结果:1)生物信息学分析在骨肉瘤中表达失调的IncRNA,miRNA与mRNA和通路:结果表明,JAK-STAT信号通路在骨肉瘤组织中被激活,LINC01116与IL6R表达同时升高,二者具有正相关性(cutoff>0.8,P<0.05)。韦恩图结果表明存在26个能够同时靶向LINC01116和IL6R的miRNAs,miR-520a-3p位于其中。Kaplan-Meier生存分析结果表明miR-520a-3p与患者的生存期关系十分密切,miR-520a-3p低表达的患者生存期明显缩短。Targetscan与miRanda分析表明miR-520a-3p能够靶向结合LINC01116和IL6R的3’-UTR端。2)LINC01116与IL6R在骨肉瘤中表达上调,miR-520a-3p表达下调:建立骨肉瘤细胞系MG-63,U-20S与Saos-2和人正常成骨细胞系hFOB 1.19,qRT-PCR与Western blot分析结果表明LINC0 1116和IL6R在骨肉瘤组织与骨肉瘤细胞系中高表达,miR-520a-3p低表达,与瘤旁正常组织及人正常成骨细胞系标胶差异具有统计学意义,P<0.05,其中在MG-63细胞中表达差异最大,因此被选为后续实验所用的细胞系。3)LINC01116促进骨肉瘤细胞增殖与迁移,抑制凋亡:qRT-PCR实验结果明确了在MG-63骨肉瘤细胞中si-LINC01116的转染效果;在MG-63骨肉瘤细胞中LINC01116能够抑制miR-520a-3p的表达;在MG-63骨肉瘤细胞中LINC01116能够促进IL6R的表达。MTT实验表明LINC01116能够促进MG-63骨肉瘤细胞的增殖。流式细胞仪验证IL6R能够抑制MG-63骨肉瘤细胞凋亡。Transwell实验结果表明IL6R能够促进MG-63骨肉瘤细胞迁移。4)IL6R促进骨肉瘤细胞增殖与迁移,抑制凋亡:qRT-PCR结果验证了在MG-63骨肉瘤细胞中si-LL6R的转染效果,MTT实验表明IL6R能够促进MG-63骨肉瘤细胞增殖。流式细胞术结果表明IL6R能够抑制MG-63骨肉瘤细胞的凋亡。Transwell实验结果表明IL6R能够促进MG-63骨肉瘤的迁移。5)LINC01116,miR-520a-3p,IL6R的靶向关系:双荧光素酶实验表明miR-520a-3p+LINC01116 组荧光量降低,验证了 LINC01116 与 miR-520a-3p的靶向关系,同时miR-520a-3p+IL6R组荧光量降低,验证了 miR-520a-3p与IL6R的靶向关系;同时qRT-PCR实验结果表明miR-520a-3p,IL6R不能反向调控LINC01116表达,miR-520a-3p能够抑制IL6R表达,LINC01116能够促进IL6R表达。6)MiR-520a-3p抑制骨肉瘤细胞增殖与迁移并能回复LINC01116与IL6R的作用:MTT实验结果表明miR-520a-3p抑制MG-63骨肉瘤细胞增殖。流式细胞术验证了 miR-520a-3p促进MG-63骨肉瘤细胞凋亡。7)MiR-520a-3p抑制JAK-STAT信号通路相关蛋白磷酸化水平:Western-blot实验结果表明JAK-STAT信号通路相关蛋白JAK2,STAT3蛋白的磷酸化水平被 miR-520a-3p 抑制,被 LINC01116,IL6R 所促进。8)LINC01116促进小鼠体内的骨肉瘤增长:下调LINC01116后,小鼠体内骨肉瘤体积与重量较对照组明显减小。结论与创新点本研究通过生物信息学及体内体外实验系统阐明LINC01116在骨肉瘤发生发展中的变化特点以及发挥作用的机制,即骨肉瘤中LINC01116的表达水平上调,其通过靶向抑制miR-520-3p的表达进而调节IL6R的表达水平,而IL6R的高表达将激活JAK-STAT信号通路,进而促使骨肉瘤细胞的增殖与迁移,抑制其凋亡。本研究进一步完善了骨肉瘤中长链非编码RNA的调控网络,并通过体外实验与在体实验明确证实,骨肉瘤中LINC01116的表达水平下调或miR-520a-3p的上调将抑制骨肉瘤的发生与发展,为临床骨肉瘤诊治寻找新的靶点提供了理论及实验支持。