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肺癌是当今世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,当前肺癌患者的平均5年生存率仍低于15%。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSC)理论在肿瘤发生学领域中受到广泛重视,大量证据表明CSC是肿瘤不断复发转移、难以治愈的根源。因此,以CSC为治疗靶点探寻遏制肺癌发生发展的新方法是当前肺癌研究的热点之一。 研究表明:恶性肿瘤的发生、发展与摄入多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fattyacids,PUFA)的种类和数量关系密切。目前研究的较多的是α-亚麻酸(Linolenicacid,LA)、二十碳五烯酸(ecosapeatanolic acid,EPA)、二十二碳六烯酸(ducosahexenoicacid,DHA),已有研究表明他们对肿瘤的发生、发展有抑制作用,但大量临床试验确未能证实其能遏制肿瘤发生。近年来,人们又把更多的注意力投向了PUFA的微量组分——共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA),CLA是亚油酸的同分异构体,c9,t11CLA和t10,c12 CLA是CLA最主要的两种异构体,新近研究结果表明,它们具有较EPA、DHA更强的抗肿瘤活性,但关于其抑制肺癌发生发展的机制研究仍然较少,尤其对肺癌干细胞是否具有遏制作用尚不清楚。 本研究拟首先比较LA、EPA、DHA、c9,t11-CLA及t10,c12-CLA抑制A549、SPC-A-1细胞株肿瘤功能的能力以及抑制CD133+干细胞微球形成和分化的能力,筛选出抑制作用最强的组分,并在肺癌干细胞荷瘤小鼠模型中进一步验证其体内抗肿瘤效应,并探索可能的分子机制。 第一部分 人肺腺癌细胞株A549、SPC-A-1干细胞的体外培养及鉴定 目的:以人肺腺癌细胞株A549、SPC-A-1为研究对象,无血清培养诱导干细胞微球形成,并通过检测干细胞相关标志鉴定其肿瘤干细胞属性。 方法:采用超低粘附板,无血清条件下培养肺癌干细胞,加入表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)等细胞生长因子诱导球体形成;倒置显微镜观察干细胞微球形成形态,有血清培养状态下观察干细胞分化状态,流式细胞仪检测肿瘤干细胞标记物CD133表型,RT-PCR及Western Blot分别检测胚胎干细胞标记物OCT-4的mRNA及蛋白水平。 结果:A549、SPC-A-1肺腺癌细胞经无血清DMEM F-12培养基培养2~4周,即可形成悬浮生长的细胞球体,而在有血清条件下培养呈分化状态;在A549细胞株中CD133+所占的比例:分化状态为8.54%,肿瘤干细胞中微球中为40.81%,P<0.001;SPC-A-1细胞株CD133+所占的比例:分化状态为8.61%,干细胞微球中65.14%,P<0.001。RT-PCR检测A549、SPC-A-1细胞株Oct-4 mRNA表达水平显示在肿瘤干细胞球体中比分化状态下具有更强的表达,P分别为<0.001,<0.05; Western Blot检测A549、SPC-A-1细胞株Oct-4蛋白表达,在干细胞球体中比分化状态下具有更强的表达,P分别为<0.001,<0.01。 结论:A549、SPC-A-1肺腺癌细胞经无血清培养,可形成悬浮生长的细胞球体,球体细胞中肺癌干细胞高度富集,CD133,OCT4高表达是肺腺癌干细胞的主要特征。 第二部分 抑制肺腺癌干细胞作用最强PUFA组分筛选及其分子机制的体外研究 目的:比较PUFA各有效成分抑制肺腺癌干细胞增殖及迁移能力,筛选出最强组分,并探讨其量效关系及分子机制。 方法:对A549及SPC-A-1进行无血清培养,待CSC微球形成后,每日分别加入50umol/L的LA、EPA、DHA、c9,t11-CLA、t10,c12-CLA,连续三天。分别行干细胞微球形成观察、干细胞微球定量分析,筛选出最强组分。加入不同浓度最强组分进行浸润、侵袭试验,Western blotting检测不同浓度最强组分作用下的干细胞球体中COX-2、CXCR4蛋白水平。 结果:干细胞微球定量分析显示:除LA外,EPA、DHA、c9,t11-CLA、t10,c12-CLA都可不同程度地抑制A549及SPC-A-1干细胞微球的形成。在两种细胞株中,与EPA及DHA组相比,同等浓度CLA组平均干细胞微球个数及单个微球干细胞密度均显著下降,表明两种CLA为抑制作用最强组分。 选取最强组分CLA行迁移及浸润试验:c9,t11-CLA、t10,c12-CLA均能不同程度地抑制肺癌干细胞的迁移及浸润能力,随着浓度的增加,抑制作用增加,两者混合物的抑制作用最强。Western blotting检测COX-2、CXCR4蛋白水平:在A549及SPC-A-1肺腺癌干细胞中,c9,t11-CLA、t10,c12-CLA均可不同程度地抑制COX-2、CXCR4蛋白水平,并表现出剂量依赖性,而两者混合物组抑制作用最强。 结论:PUFA组分EPA、DHA、c9,t11-CLA、t10,e12-CLA对A549及SPC-A-1干细胞微球都有不同程度的抑制作用,其中c9,t11-CLA、t10,c12-CLA为最强组分。c9,t11-CLA、t10,c12-CLA体外试验能够不同程度的抑制肺腺癌干细胞的浸润和迁移能力,并具有剂量依赖性;CLA抑制肺腺癌干细胞增殖及迁移的分子机制与抑制COX-2表达从而下调SDF-1/CXCR4通路相关。 第三部分 c9,t11-CLA及t10,c12-CLA抑制肺腺癌干细胞增殖及转移的体内研究 目的:建立肺腺癌干细胞荷瘤动物模型,进一步体内验证CLA抑制肺腺癌增殖及转移的作用及分子机制。 方法:采用新霉素和克隆挑选技术分别建立稳定表达绿色荧光蛋白GFP的A549及SPC-A-1细胞株,体外培养富集干细胞微球,建立肺癌干细胞原位荷瘤裸鼠模型,腹腔注射给予不同组分c9,t11-CLA、t10,e12-CLA、及混合组,定期检测裸鼠体重及肿瘤重量,研究终点采用小动物活体荧光成像技术分别观察肿瘤转移情况,Westernblotting检测肿瘤组织COX-2、CXCR4的蛋白表达水平 结果:原位荷瘤裸鼠模型经CLA各组分处理后,肿瘤荧光成像显示:不管是在A549干细胞组,还是SPC-A-1组,肿瘤原发灶及转移灶均有明显的减退,CLA混合组更显著。 肿瘤转移情况比较:与对照组相比,纵隔淋巴结、对侧肺、下颌及远处皮下转移率均受到CLA的抑制。A549及SPC-A-1两种干细胞荷瘤模型中,下颌及远处皮下转移率几乎完全抑制。而CLA混合组作用抑制转移作用更强。 Western blotting检测OCT4、COX-2、CXCR4蛋白表达水平:在A549肺腺癌干细胞组,c9,t11-CLA、t10,c12-CLA均不同程度地抑制OCT4、COX-2、CXCR4蛋白,混合物组抑制作用最强。在SPC-A-1肺腺癌干细胞组,结果类似。 结论:c9,t11-CLA、t10,c12-CLA、及其混合物能明显抑制肺腺癌干细胞荷瘤裸鼠原发肿瘤和转移灶的生长;CLA组分能明显抑制肿瘤组织OCT4、COX-2、CXCR4蛋白表达,体内验证了抑制COX-2表达从而下调SDF-1/CXCR4通路可能是CLA抑制LCSCs的重要机制。