羰基还原酶属于氧化还原酶类,广泛存在于细菌、真菌、酵母和动植物体内,以辅酶NAD（P）+或NAD（P）H作为电子受体和供体,可以特异性地催化酮（醛）和醇之间的相互转化,用于合成重要价值的羟基化合物。近年来,近平滑假丝酵母Candida parapsilosis整细胞或其来源的羰基还原酶凭借其广泛的底物谱和优良的催化特性,在香精、功能食品和药物的研发中得到广泛应用。本课题组在前期研究中得到了一株近平滑假丝酵母ATCC 7330,该菌株能够催化多种羰基化合物不对称还原生产相应的醇,有良好的底物特异性和立体选择性,具有巨大的应用潜力。本研究克隆了近平滑假丝酵母ATCC 7330中的羰基还原酶基因（cpcr）,构建重组菌E.coli BL21（DE3）/p ACYCDuet-1-cpcr。并采用Ni-Agarose亲和层析对重组酶CpCR进行分离纯化得到纯酶。以苯甲醛为底物,系统研究了重组CpCR在不同温度、pH、金属离子等条件下的酶学性质。另外还通过Discovery Studio 2017软件对该羰基还原酶CpCR进行建模和分子对接,筛选出与柔性区域的几个关键氨基酸,设计该酶的突变体。通过定点突变,考察这些位点对酶活性和在不同温度、剪切力、辅酶浓度、单相/双相条件下的酶稳定性的影响。相应的结果如下:（1）成功克隆了近平滑假丝酵母Candida parapsilosis ATCC 7330中的羰基还原酶基因cpcr,并在大肠杆菌BL21（DE3）中实现了异源表达。实验结果表明:该羰基还原酶CpCR基因序列全长1107 bp,编码368个氨基酸,重组酶分子量大小在41 kD左右。重组酶CpCR分离纯化后对底物苯甲醛的比酶活为20 U/mg。（2）该重组酶的酶学性质研究表明:重组酶CpCR在4-33℃温度范围内稳定性强,相对酶活在80%以上,但随着温度逐渐升高,酶活下降较快,T50值为37℃;该重组酶CpCR的适宜p H范围在6.2-7.5之间,在酸性和碱性条件下稳定性差;该重组酶CpCR在K+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+的常见金属离子中,在5 mmol/L条件下均有一定抑制,其中Cu2+对该酶的抑制作用最强,相对酶活下降50%左右;通过该酶对底物的亲和力和催化特性的研究表明,该酶对底物苯甲醛、正丁醛亲和能力强于COBE（4-氯-3-酮基-丁酸乙酯）,对苯甲醛或正丁醛的催化效率是对COBE的20倍;该重组酶CpCR是一种NADPH依赖型的羰基还原酶。（3）将该酶与辅酶NADPH的柔性区域氨基酸残基采用虚拟氨基酸进行饱和突变扫描,计算突变能,筛选突变位点,确定影响羰基还原酶CpCR与辅酶NADPH结合的柔性区域的特殊氨基酸位点Ala98、Ser258、Ser216、Ser307、Gly262,构建突变文库A98N、S307N、G262N、S216N和S258N,制备相应突变体酶。（4）研究了5种突变体酶在耐有机溶剂、耐温、耐剪切力、耐氧、辅酶NADPH浓度等方面的稳定性变化特点。研究表明,A98N在磷酸盐缓冲溶液中比酶活力提高10%,而S307N没有酶活力,其他3个突变体比酶活力均有降低;A98N和G262N在PB-甲基叔丁基醚的双相体系中界面稳定性比wt CpCR分别提高1.7和1.4倍;四个突变体酶的耐热特性略有下降,T50值介于31-36℃;在100 rpm和200 rpm条件下,4个突变体耐剪切力均增强,在300 rpm条件下G262N突变酶的耐剪切稳定性比wtCpCR增强1.3倍;G262N突变酶在有氧条件下的稳定性更好,比野生酶提高1.4倍,t1/2值达到11.87 h;在0-0.4 mmol/L辅酶浓度范围内,G262N突变酶更加稳定。