真核细胞是高度分隔的,区域化为个体代谢途径提供了独特的环境条件,细胞中各种微小的精密生物分子协同转运,实现新陈代谢和各种生命活动,造就了五彩缤纷的大千世界。因此,在单细胞单分子水平层面准确和灵敏地探究这些生物分子的活动、异常表达变化、对外界刺激的响应等,会使我们对生命的理解更深入,更好的利用生命活动。这些研究一直是生命科学中的重要议题。在追寻探索之路上,核酸分子被认为是最有潜力的研究材料。作为储存、遗传信息载体,它们在生命过程中发挥着至关重要的作用。除了生物学上的功能,核酸分子有着独特的性能。其中,DNA的双螺旋结构通过互补碱基之间的氢键来稳定,DNA链之间的杂交可通过Watson-Crick相互作用力而被预测。随着科学研究的深入,在DNA分子上修饰上各种活性官能团已经成为可能。同时,人们对功能化的DNA分子,如DNA三链体、核酸适配体及DNAzyme等的性能也有了进一步理解,DNA已被证明能够用于精确构建纳米结构和可编程反应,可被成功用于生物传感器的构建。第二章提出了一种应用于高灵敏活细胞原位m RNA成像的新型支化HCR（b HCR）反应。近来年,研究表明m RNA的异常表达与多种疾病密切相关,m RNA表达是多样化的,错过一些低丰度亚群,或者不明显的表达量差异可能会妨碍我们对m RNA功能的了解和对相关疾病的早期诊疗。杂交链反应（HCR）对低丰度的m RNA检测是个有效的方法,但现有的HCR受限于有限的放大效率、有限的分辨率或者复杂的设计方案。该b HCR反应通过将两组HCR反应分层次的组合在一起,使得一个单个目标引发链上生成一个超支化组装,从而可以在单细胞层面下原位检测活细胞里单个分子。体外数据表明b HCR有很高的反应效率和单碱基错配区分能力,检测下限达到了500 f M。活细胞研究表明b HCR在活细胞中对目标m RNA展现出了很强的荧光斑点,并且分辨率增强。该b HCR方法有望为低丰度的生物标志物检测及细胞生物学成像和诊断提供有用的平台。第三章提出了一种p H响应的、完全可逆的杂交链反应（HCR）,实现了活细胞的p H灵敏检测和成像。活细胞的p H分布和变化的监测非常重要。我们的设计依赖于作为脚趾的三链形成DNA序列可在酸性条件下形成三链结构,然后引发一系列的链置换和DNA反应。该HCR反应在生理p H范围内有动态响应、优越的可逆性,并且具有体外的p H检测和活细胞成像的性能。另外,该方法由于HCR组装体的形成,在细胞内产生了高度集中的信号,提高了检测的灵敏度和选择性。该p H响应的可逆的DNA杂交链反应有望为p H相关的细胞生物学研究和疾病诊断提供一个有用的平台。第四章提出了一种锚定在细胞膜上的DNA纳米机器,它能够根据外界p H刺激而改变结构,实现了细胞外部微环境的p H动态可调的传感及成像。该DNA纳米机器通过在p H的变化下进行两链、三链杂交的转换,产生结构差异,生成信号传感及成像细胞外p H。实验结果显示该纳米机器可以通过多位点锚定而稳定的锚定在细胞膜外,并且通过调控转换部件中C+·G-C比率而改变p H响应窗口。同时,该DNA纳米机器也展示了很好的灵敏度、可逆性和定量检测和成像p H的能力。第五章提出了一种新型智能诊断纳米机器,实现了活细胞中多个mi RNA分子的逻辑关系的可视化分子诊断。该纳米机器通过集成纳米金颗粒和核酸分子的优势,其中包括细胞递送、核酸传感、信息运算以及结果输出,可以在活的哺乳细胞中执行基于逻辑门的分子诊断。以mi R122和mi R21为例,在活细胞中成功构建了两种基础逻辑门（AND门和OR门）。实验结果显示,诊断型纳米机器有很好的细胞递送效率和生物相容性,能够在哺乳细胞中执行基于逻辑门的分子诊断,且检测结果准确快速。