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脑胶质瘤是常见的原发性中枢神经系统肿瘤,发病率高、致死率高。手术、放疗和化学疗法等对于脑胶质瘤患者的存活率方面并未取得重大改善,针对恶性脑胶质瘤需要开发新的治疗方法。近年来,基因组编辑通过编辑DNA序列或调节基因表达,为肿瘤治疗提供了新的解决方案。CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是迄今为止最简单精确的基因组编辑机制之一。簇状规则的短回文重复序列CRISPR/Cas9可以从基因组中彻底删除一个基因,从而达到治疗疾病的效果。Cas9/sg RNA核糖核蛋白(Cas9-RNP)由Cas9蛋白和向导RNA(sg RNA)结合构成,Cas9-RNP复合物体内稳定性差、难以穿过血脑屏障(BBB)、不具有肿瘤靶向性等先天缺陷,制约其有效地应用于恶性脑胶质瘤的治疗。开发及设计Cas9-RNP脑靶向递送体系,安全、有效地递送到病灶并应用于体内治疗,对治疗恶性脑胶质瘤、改善病患预后生存具有指导意义。本论文中,我们合成一种Angiopep-2多肽修饰的含有胍基和氟基团的高分子聚合物,其能够通过胍基与Cas9-RNP的电荷相互作用以及氟基团的疏水作用,有效包裹Cas9-RNP,进而形成纳米药物(Ang-NP@Cas9/sg RNA),实现在血液中稳定循环并保持其蛋白活性的目标。氟基团的存在还有利于Cas9-RNP纳米药物逃离内涵体,且纳米药物表面修饰的Angiopep-2多肽可以与BBB内皮细胞及脑胶质瘤表面的低密度脂蛋白受体(LRP)识别结合,使其有效穿过BBB并且靶向递送至脑胶质瘤细胞。动态光散射表征及ζ电位结果表明,该纳米药物水动力半径为149 nm、表面电位为8.3 m V;透射电子显微镜(TEM)结果表明该纳米药物形貌为球形且大小分布均一;圆二色谱仪结果表明,高分子聚合物的包裹并未影响蛋白Cas9的活性。随后,我们利用恶性脑胶质瘤细胞(U87MG)评估Ang-NP@Cas9/sg RNA纳米药物在细胞水平的表现。共聚焦和流式结果表明,Ang-NP@Cas9/sg RNA纳米药物能够被U87MG细胞有效内吞并具有显著的靶向效果。同时,由于氟基团的介入,该纳米药物能够高效逃离内涵体,随后成功进入细胞核。MTT实验结果表明,Ang-NP@Cas9/sg RNA纳米药物具有良好的生物相容性。细胞水平基因编辑结果表明,Ang-NP@Cas9/sg RNA靶向Polo样激酶1(PLK1)基因进行基因编辑可以达到32%的插入/缺失(Indel),使蛋白的表达量降低67%,而无Ang多肽修饰对照组NP@Cas9/sg RNA和非PLK1靶向对照组Ang-NP@Cas9/sg Scr蛋白表达量分别降低41%和11%。此结果证实了Ang-NP@Cas9/sg RNA纳米药物的细胞靶向性和PLK1基因特异性。由于PLK1基因与细胞增殖有关,降低PLK1蛋白的表达会促进细胞的凋亡。细胞凋亡实验证实了此推测,Ang-NP@Cas9/sg RNA使细胞的凋亡达到37.2%。小鼠体内药代动力学的研究表明,相比于游离Cas9-RNP(11 min),Ang-NP@Cas9/sg RNA的血液半衰期为40 min,血液稳定性显著性提升。体内小鼠原位脑胶质瘤模型研究结果显示,Angiopep-2具有良好的脑靶向性,纳米药物可以成功穿过BBB并且在肿瘤部位高效积累。我们构建原位脑胶质瘤模型进行肿瘤治疗效果评估,结果表明Ang-NP@Cas9/sg PLK1可以成功的抑制肿瘤的生长,且体重变化较小,治疗小鼠的生存中位值显著提高(40天)。PBS、Ang-NP@Cas9/sg Scr和NP@Cas9/sg RNA对照组的生存中位值分别为18天、22天、27天。此结果验证了Ang-NP@Cas9/sg PLK1的脑靶向性、基因特异性以及良好的抗肿瘤效果。组织学分析发现纳米药物可以有效抑制肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤组织凋亡。WB的结果说明,Ang-NP@Cas9/sg PLK1纳米药物对小鼠肿瘤组织PLK1蛋白表达水平降低了66.7%。值得一提的是,虽然在生物分布中Ang-NP@Cas9/sg PLK1纳米药物在心、肝、脾、肺、肾均有分布,但是通过组织学分析发现纳米药物对于各组织并没有毒副作用。综上所述,本论文构建了一种Angiopep-2多肽修饰含有胍基/氟基团的高分子聚合物装载Cas9/sg RNA核糖核蛋白的纳米药物治疗脑胶质瘤。该纳米药物具有很好的血液循环稳定性,可以有效穿越BBB、高效靶向至脑胶质瘤细胞、快速逃逸内涵体,从而发挥其基因编辑的作用。细胞和动物水平相关实验表明此纳米药物具有很好的基因编辑和体内治疗脑胶质瘤的效果,为脑胶质瘤的治疗提供了新的方法。