中药海金沙[Lygodium japonicum(Thunb)Sw.]是蕨类海金沙科(Lygodiaceae)海金沙属(Lygodium)多年生草质藤本植物。研究表明海金沙具有清热解毒、利胆消肿、抗菌等药理活性,然而,对海金沙抗血管生成的作用却鲜有报道。本文采用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型筛选海金沙抗血管生成的活性部位,并对其提取精制工艺进行优化,制备活性部位。采用高效液相色谱法(HPLC)对海金沙活性成分经大鼠灌胃给药后吸收入血的成分进行分析,为揭示海金沙抗血管生成药效物质提供一定实验依据。研究目的:本文采用CAM模型筛选海金沙提取物中具有抗血管生成作用的活性部位,优选其提取精制工艺,制备提取物,为海金沙的开发和应用提供实验依据。研究方法:1.采用系统分离法,分别以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇为提取溶剂,对海金沙全草提取液进行提取,制备海金沙石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物。2.采用CAM模型,以加药口处新生血管增长百分率为指标,比较海金沙石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物抗血管生成活性。3.采用显色反应,盐酸-镁粉、盐酸-锌粉反应试验、氯化铝的络合反应试验、4%氢氧化钠溶液及紫外-可见光谱及海金沙正丁醇部位指纹图谱的建立,对抗血管生成活性部位进行分析,确认海金沙正丁醇提取物所含成分的类别。4.制备海金沙抗血管生成活性部位,应用CAM模型对其抗血管生成活性进行验证;以鸡胚卵黄囊膜(YSM)血管生成模型对CAM模型筛选出的抗血管生成活性部位进行进一步研究。5.采用L9(34)正交法,以浸出物得率和海金沙血管生成活性部位含量为指标,进行海金沙提取工艺的优选,考察提取溶剂浓度、用量、提取时间等因素对提取效果的影响,确定最优提取工艺条件。采用冷藏静置法,以总黄酮的含量及叶绿素清除率为指标,考察提取物浓度对除叶绿素效果的影响。6.采用柱分离技术分离活性部位提取物,获得不同浓度乙醇洗脱部位,以CAM模型对其进行抗血管生成作用的筛选,并进行验证试验。7.应用大鼠血清药化方法,以50%乙醇洗脱部位作为药物组,进行灌胃处理,制备空白血清组、空白血清+药物组、药物组及含药血清组,采用液相色谱技术对海金沙入血成分进行分析。结果:1.海金沙石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物对CAM血管生长均有一定的抑制作用,正丁醇提取物抑制作用最强,其次为乙酸乙酯提取物。2.采用盐酸-镁粉、盐酸-锌粉反应试验检测海金沙正丁醇提取物,结果出现红色泡沫;采用氯化铝的络合反应试验反应为黄色;采用4%氢氧化钠溶液对正丁醇提取物进行显色反应为棕红色。采用紫外-可见光谱测定可知,海金沙正丁醇提取物与芦丁对照品显色后吸收峰均在510nm附近;通过对海金沙正丁醇部位进行高效液相指纹图谱的建立,分析吸收光谱特征。综合以上实验结果,初步判断正丁醇提取物主要含有黄酮类化合物。3.CAM模型高、中剂量药物组加药口处血管生成明显减少,YSM模型高、中剂量药物组新生血管密度增长率及数目均明显减少,可以推测海金沙总黄酮对血管生成有一定的抑制作用,并呈现剂量依赖性。4.采用L9(34)正交法,进行海金沙提取工艺的筛选,由极差和方差分析结果可知,对有效成分提取率影响因素依次排列为乙醇浓度>提取时间>溶剂用量,结果显示乙醇浓度有显著性差异,故确定海金沙总黄酮最佳提取工艺为:乙醇浓度为50%、乙醇用量为18倍药材量、提取2次、每次2h。5.采用冷藏静置法,除去提取液中叶绿素,实验结果显示,样品溶液浓度为0.5g生药/ml时,提取液中叶绿素含量最低。6.海金沙总黄酮经过柱分离后所得4个不同醇浓度洗脱部位中,乙醇浓度为50%洗脱部位对鸡胚新生血管抑制作用最强。确定乙醇浓度为50%洗脱部位为抗鸡胚血管生成的有效部位,确定最佳浓度为9.6g生药/ml。7.以血清药化学方法,通过液相色谱技术分析大鼠血清。通过比较各高效液相色谱图可知,有6个成分保留时间相同,入血后新产生5个吸收峰,可能经过吸收后,该5个成分为代谢物,需进一步对给药成分进行研究确定。结论:本研究通过对海金沙进行逐级分离分析与鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型相结合的方法,确定海金沙提取物中抑制鸡胚血管生成最佳部位为50%乙醇洗脱海金沙黄酮部位。采用L9(34)正交法及冷藏静置法,确定海金沙总黄酮最佳提取工艺为:乙醇浓度为50%、乙醇用量为18倍药材量、提取2次、每次2h。样品溶液浓度为0.5g生药/ml情况下,进行冷藏静置滤过进行分离精制处理。并通过大鼠血清药化方法,灌胃给予50%乙醇洗脱部位,经HPLC分析所得血清,有6个成分保留时间相同,入血后新产生5个吸收峰,可能经过吸收后,该5个成分为代谢物,需进一步对给药成分进行研究确定。