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胰岛素是治疗糖尿病的特效药。临床上使用的胰岛素来源有基因工程人胰岛素,半合成人胰岛素和天然动物胰岛素。而不管哪种方法,为得到高纯度(>99%)的胰岛素,均需要一系列的分离纯化步骤。二维和多维液相色谱法因分离能力强大而在生物制药方面有广阔的应用前景。纯化过程需要高产率,短工艺,及易于保持蛋白质的生物活性.传统模式的二维和多维液相色谱法均需要使用多根色谱柱。而单柱二维液相色谱是一种具有一些独特优势的混合模式色谱。此方法中使用的二维色谱柱能分别在两种色谱模式下使用,且具有比单模式色谱柱更强的分离能力和更高的选择性,并能减少色谱填料的消耗,在分析色谱和制备色谱方面均具有独特的优势。本研究结合胰岛素的理化性质特点,初步构建了一种无需收样,再进样和额外在线缓冲溶液交换系统的最简单的在线维液相色谱法,并用其从牛胰腺粗提物中分离得到了高纯度的胰岛素,为进一步工业化打下了基础。全文包括四个部分：1.文献综述：详细介绍了混合模式色谱的发展过程,特点,混合模式的种类及其组合,机理的解释和在生物大分子分离方面的应用,包括38篇参考文献,其中近三年文献占50%。2.实验方法：包括本论文所涉及的所有实验过程中需要用到的各种仪器,试剂,以及实验操作方法。3.通过对配体中含有3个乙基,1个季胺和1个羟基的强阴离子交换／疏水(SAX/HIC)二维色谱柱分离胰岛素的SAX和HIC色谱条件进行优化,在最优化的色谱条件下,采用先SAX后HIC的离线单柱二维液相色谱,对牛胰腺粗提液中的胰岛素进行了分离纯化,得到了较高纯度的胰岛素,但产品纯度还有待提高。4.在前一章内容的基础上,为提高胰岛素纯度,从SAX/HIC系列的色谱柱中选出一种配体中含有3个正辛基,1个季胺和1个羟基的的SAX/HIC二维色谱柱,找出了一种合适的色谱条件,使SAX和HIC共用一套流动相,并使胰岛素在SAX和HIC梯度洗脱时不被洗脱,而其他杂蛋白均能被洗脱,从而对胰岛素具有优异的选择性。在最后一维色谱分离模式中用反相洗脱并利用RPLC的分离能力将产品进一步纯化,从而省掉了常规多维色谱所需的在线收样,缓冲溶液交换及再进样系统和相关的复杂操作,初步构建了一种最简单的在线多维液相色谱体系。本研究中尝试了以SAX-RPLC, HIC-RPLC和SAX-HIC-RPLC三种分离模式从牛胰腺粗提液中纯化胰岛素,可以在17-32分钟内得到高纯度的胰岛素,质量回收率为85.4%-120%。