本论文工作的主要贡献是研究了多种不同的新型无机介孔材料在生物质谱以及蛋白分子特异性富集和快速酶解技术中的首次应用，对将生物分析科学与介孔材料科学领域的结合进行了探索性的研究，具有一定的理论和现实意义。 生物质谱在最近的20多年间得到了迅猛的发展。由于其信号检测灵敏、速度快以及种类多样化的优点，生物质谱已经成为生物分析领域中最前沿研究如蛋白组学研究的支撑技术。其中，以基质辅助激光解吸(MALDI)为离子化方法、以飞行时间(TOF)为质量分析器的生物质谱，具有良好的质量精度、分辨率和灵敏度，且操作简便，常常被用于分子量大于500的肽段测定和通过肽质量指纹谱(PMF)进行蛋白鉴定。另一方面，实际的生物分析样品大多是组成复杂的混合物，在进行生物质谱测定之前需要进行分离、富集等处理；在进行肽段分析之前，蛋白样品也需进行彻底的酶解反应。目前，随着低丰度的后修饰蛋白的深入研究和以小分子为对象的代谢组学的兴起，进一步发展生物质谱技术对于小分子样品的分析、低丰度蛋白的富集和快速酶解新技术显得尤为重要。 自90年代初，介孔材料MCM-41首次被合成以来，介孔材料的制备方法得到了不断的完善，已日趋成熟，这使得介孔材料的种类和结构也得到不断地创新和突破。新型的介孔材料具有不同的组成、较高的比表面积、较大的孔径、开放的孔道等特点，在吸附、催化、光学和电子器件等方面有着潜在的应用前景。目前，如何将合成的介孔材料投入到实际应用中去是材料学家们思考的焦点问题，尤其是随着介孔材料对生物分子吸附行为的不断研究，与生物分子具有相融性的介孔材料在生物技术中的应用越来越引起人们的关注。同时，将介孔材料应用到生物技术中也为解决现存的生物分离、分析技术问题提供了新的切入点。 本论文工作共包括以下三个部分： 第一部分介孔MALDI基质的研究 有机基质的引入使得MALDI质谱在生物分子的分析领域中取得了成功而广泛的应用。但同时有机基质本身也存在着一些不可避免的问题，如低分子量范围内的复杂背景的存在严重影响了小分子样品的测量，有机基质的MALDI对生物样品中的共存金属盐的耐受度也很有限，盐对质谱信号的抑制作用明显。无机材料作为MALDI基质的研究一直受到关注，尤其是近几年，无机基质的灵敏度和产生的谱图效果都有了进一步的提高。 本论文研究了介孔材料作为无机基质在质谱中的应用。实验结果发现，不同组分的介孔材料对分析物的电离能力表现出极大差异，材料对样品的电离能力与其紫外吸收趋势相一致，即紫外吸收越强，电离能力越强。以紫外吸收强的氧化钛-氧化铈混合氧化物(CeTiO)为基质检测低皮摩尔级浓度的聚丙酸甘油(PPG)，可以得到信噪比良好的谱图，这相对于已有文献所报道的纳摩尔级检测水平有了很大的提高。以标准的环十肽Gramicidin S为样品分别测试了四种具有不同孔结构的氧化钛-氧化钨混合氧化物(WTiO)作为MALDI基质时的质谱信号，发现以有序介孔材料作为基质解吸得到的样品离子强度明显高于无孔和无序介孔材料，其原因可能是有序介孔结构既为吸附生物分子提供了高的比表面积，同时又有利于样品分子的解吸过程。利用有序介孔基质成功地检测到低分子量小肽，弥补了有机基质的弱点。相对于有机基质，介孔材料也显示出极好的耐盐性，样品溶液中共存的钾盐成份并没有抑制肽信号的检测，相反地，可以有效地提升样品的信号强度。在优化了的样品制备条件下，有序介孔基质对复杂的马心肌红蛋白的酶解肽段进行检测，并利用PMF方法成功完成蛋白鉴定；同时选择了较短的酶解肽段HKIPIK进行了有效的串级质谱分析。本部分的研究显示有序介孔无机基质有望在小分子(如药物分子)和生物短肽的MALDI-TOFMS分析中得到广泛的应用。 第二部分介孔氧化铁对生物分子的特异性 富集磷酸化修饰是蛋白组学中蛋白翻译后修饰研究的重要内容。由于磷酸化蛋白质在生物体内的含量很低，以及磷酸肽在正离子模式质谱中的离子化效率较低，所以在对它的质谱检测和位点分析之前需要进行富集、分离预处理。目前最广泛采用的磷酸化肽段富集技术是固定金属亲和色谱法(IMAC)，此方法中，键合在螯合底物上的金属离子(通常是Fe3+或Ga3+)选择性地与磷酸化肽相结合，并且在高pH或磷酸缓冲液中可以释放出磷酸化肽，从而实现其与非磷酸化肽的分离。但该方法操作复杂，混合液中含有带较多酸性残基的肽段时的亲和选择性较低，虽然利用其螯合铁填料直接点样进行质谱检测可以简化操作，但对多磷酸化肽段具有一定的歧视效应。 本论文发展了一种利用介孔氧化铁对磷酸化肽段进行富集分离、直接进行靶上点样分析的简易新方法。首先利用尿素和甲醛的缩聚来诱导氢氧化铁溶胶粒子间的聚集、高温焙烧获得晶化了的大孔径氧化铁微球材料，然后将大孔径氧化铁微球材料用于磷酸化肽段的富集分离。通过一系列的富集条件优化实验，选择在含有30％乙腈、0.1％乙酸的溶液中进行氧化铁微球分别对非磷酸化和磷酸化磷蛋白混合物、磷酸化蛋白混合物的酶解肽液中的磷酸化肽段进行的选择性亲和吸附，离心、去上层清液后，利用pH值为10的氨水溶液重新分散氧化铁沉淀，将所得氧化铁颗粒悬浮液直接点样后进行质谱分析，结果显示出介孔氧化铁对磷酸化肽段具有快速、有效的富集分离能力。与传统IMAC方法相比较，介孔氧化铁富集技术步骤简单，具有更高的亲和选择性。而且，这种直接点样的方法对多位点的磷酸化肽段也能够实现有效的富集、检测。同时，通过与商品化无孔的纳米氧化铁材料富集效果的比较，证明介孔氧化铁的介孔表面在高效的磷酸化肽段富集中发挥了重要的作用。 第三部分介孔材料在蛋白酶解中的应用 胰蛋白酶酶解反应是蛋白组学研究中利用质谱进行蛋白鉴定之前所必需的关键步骤。目前，蛋白组学研究中最普遍的蛋白质酶解方法包括胶上酶解和溶液酶解，但这两种酶解方法都需要较长的反应时间(数小时至过夜)，一定程度地限制了蛋白组学研究中蛋白分析的快速、高通量要求，而固定化酶技术可以极大地提高酶解速度到秒级。本论文利用大孔径硅质介孔泡沫材料(MCF)作为酶固定化材料以及毛细管柱填料，对蛋白柱上酶解进行初步探索。通过蛋白自动进样系统，溶解在碳酸缓冲液中的标准马心肌红蛋白，在以纯水为流动相的条件下，经过装有已固定蛋白酶的二氧化硅介孔泡沫填料的毛细管柱，流出液直接点靶板进行质谱分析，结果表明该酶解技术方法快速、高效，在秒级的酶解反应时间内，酶解肽段覆盖率达95.42％，远远高于相同时间内传统溶液酶解所得肽段的覆盖率(26.79％)。而用孔径较小的SBA-15作载体的毛细管柱酶反应器所得的酶解肽段覆盖率仅为22.22％，原因可能是介孔泡沫的超大孔径能够保证蛋白在柱中已吸附有蛋白酶的介孔孔道里自由扩散，大大增加了蛋白与酶的接触机率，从而提高了酶解效率。利用大孔径MCF材料填充的毛细管柱酶反应器还具有可在常温下进行酶解、可重复使用、酶活性持久的优点。另外，在MALDI靶板上也可以实现蛋白的快速酶解。 本论文考察了多种介孔材料(包括FUU-12、SBA-15和WTiO)对靶上酶解效率的影响，实验结果表明，在靶板上加入适量的介孔材料可以有效地提高酶解效率。而结构相近的SBA-15和WTiO对靶上酶解效率提升的程度不同，SBA-15的提升程度相对地小一些，原因可能是WTiO的MALDI基质特征有利于酶解产物从材料表面的解吸。