研究背景:癌症在医学上是指起源于上皮组织的恶性肿瘤,它是由于生命体在各种致瘤因素(物理、化学等)的作用下,局部组织的正常细胞在基因水平上失去了对其生长发育的正常调控导致了异常的增生与分化,从而形成的肿块。并且这种肿块的生长将不再受机体的生理调节,它会破坏正常的组织和器官,这决定了其一旦形成便不因病因消除而停止生长。尽管人们尚未完全了解恶性肿瘤的病因,但随着多年的科研实验、流行病学研究及和临床观察,发现与环境因素有关的恶性肿瘤大约在80%以上。各种各样的致癌因素(环境、遗传等)可能会以协同或者序贯的方式使细胞的DNA发生非致死性的损伤,这将激活原癌基因或(和)失活肿瘤的抑制基因,加上调节凋亡的基因和(或)DNA修复基因的改变,细胞便发生转化。这些转化的细胞会先呈多克隆性增生,经过一个比较漫长的多阶段的演进过程,某个克隆开始相对无限制扩增,通过某种附加突变,将选择性地形成具有不同特点的亚克隆,进而获得浸润能力和迁移能力,形成恶性肿瘤。所以从本质上来说肿瘤是一种基因病。目前已发现的肿瘤致病基因有40多种,它们编码的蛋白产物包括蛋白激酶、生长因子和GTP-结合蛋白等。很多癌基因蛋的白和生长因子的受体都属于蛋白激酶,并且转化细胞跟正常细胞相比显示更高的蛋白磷酸化水平。另外,在蛋白激酶的控制之下,这种磷酸化蛋白质作为下游的效应分子,通过放大相关的信号通路,导致某些关键的基因转录异常和增殖失调,癌症由此产生。尽管医学在不断进步,癌症每年夺去数以百万计患者的生命,而且就算所谓的“灵丹妙药”也只能使患者的寿命平均延长几个星期。况且现有的药物一般情况下只能针对某一种肿瘤细胞,如果癌症的变化太大,那么看来有用的药物将不再起作用;而且即便某些药物暂时地消灭了癌症,但一些高度变异的癌细胞可能处在潜伏状态,疾病仍然会复发。目前,治疗效果不佳、毒副反应严重以及多种药物产生获得性耐受,是临床上治疗肿瘤的普遍难题,故研发特异性更强、边缘效应更小的抗肿瘤药物是现医药界面临的巨大挑战。细胞周期的失调被认为是人类癌症的重要标志,其调控机构中组成成分的改变与大部分肿瘤的发生密切相关。鉴于细胞周期的每个阶段都是为了后一期做准备,以获得两个相同遗传物质的子细胞,故细胞在进入下一时期前都要进行一种“检查”,我们称这些“检查”点为稽查点(checkpoint)或关卡。其作用是当细胞遇到外界压力或是DNA发生损伤时使细胞周期暂时停滞,这对维持基因组的稳定性是非常关键的,如果这些稽查点的功能失灵就可能导致肿瘤的形成。细胞周期有四个稽查点,分别是G1/S、S/G2、G2/M和M/G0,以G1/S和G2/M最为重要。但由于肿瘤细胞普遍有G1/S检查点缺陷的现象,并且当肿瘤细胞的DNA发生损伤后,都有选择性地滞留在G2/M期的趋势,因此该期的检查点成为研究肿瘤治疗药物的一个诱人靶标。当长时间地把肿瘤细胞阻滞于G2/M期时,一方面可以抑制肿瘤细胞的生长,另一方面又可以使肿瘤细胞累积DNA损伤而触发凋亡,从而治疗肿瘤。细胞凋亡是指由基因控制的细胞死亡,这种死亡是自主的有序的。在近几年的研究中发现,细胞凋亡的异常是癌症发生的重要原因,一些诱导细胞凋亡的基因(如Bax)的失活,以及抑制细胞凋亡基因(如Bcl-2)的过度表达,在恶性肿瘤发生过程中起着重要作用。而细胞凋亡通路的损伤是目前临床上肿瘤对治疗产生耐药性的主要原因,例如,80%的人肝癌细胞存在XIAP蛋白质过表达,来抑制caspases的激活和它的进一步活化;50%以上人肿瘤细胞中存在抗凋亡蛋白Bcl-2的表达增强等,这些机制直接或间接促进了肿瘤的发生及发展。正常的细胞周期调节机制瓦解导致细胞的异常增殖是所有癌细胞最本质的生物学特征,而细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)作为一类至关重要的细胞周期调控蛋白酶,它与细胞周期或转录调节密切相关,在肺癌、结肠癌、肺癌乳腺及恶性淋巴癌中,频繁检测出极度活跃的CDKs活性。若能开发出可以使癌症细胞周期发生紊乱以及诱导其凋亡的特异性CDKs抑制剂对于癌症的控制及治愈是非常有效的,故CDKs抑制剂特别是选择性高的CDKs抑制剂的研发一度成为了抗肿瘤药物研究中一个非常热门的领域。研究目的:以本课题组前期设计合成的ATP竞争性小分子CDKs抑制剂C-4为先导化合物,对其结构进行修饰改造,设计合成一系列二氨基嘧啶类化合物(系列Ⅰ),研究该类化合物的体外抗肿瘤活性,并在此基础上初步阐明其作用机制,为选择性的CDKs抑制剂的发现及研究提供一定的参考。研究方法和结果:1.目标化合物的合成以课题组前期发现的具有较高抗肿瘤活性的化合物C-4为先导,对其进行结构改造和优化,以2,4-二氯嘧啶为原料,经两步亲核取代反应得到10个未见文献报道的最终产物。2.MTT法检测细胞活力不同浓度的系列Ⅰ化合物分别与人结肠癌细胞株HCT 116、人宫颈癌细胞株Hela、人肝癌细胞株Hep G2和人前列腺癌细胞株PC-3共同孵育48 h后停止培养,MTT法检测发现大部分系列Ⅰ化合物能显著抑制以上四种肿瘤细胞的生长。化合物I-7对这四种细胞的IC50分别是0.4365±2.56μM,1.846±0.42μM,2.28±0.99μM,46.02±0.60μM。3.流式细胞仪检测细胞周期的分布及凋亡情况用不同浓度的化合物Ⅰ-7处理HCT 116和Hela后,发现该化合物可以改变HCT 116和Hela的细胞周期分布,且明显将细胞生长阻滞在G2/M期;不仅如此,Ⅰ-7还能诱导两种肿瘤细胞产生凋亡,并呈剂量依赖效应。4.蛋白免疫印记法检测G2/M期及凋亡蛋白的表达情况我们在研究化合物Ⅰ-7对结肠癌细胞HCT 116、宫颈癌细胞Hela相关蛋白的影响时发现,随着化合物浓度的提高以及作用时间的延长,化合物Ⅰ-7减少了p-CDK1、CyclinB1、CDK2、p21 waf1/Cip1和抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达,但是基本不改变促凋亡蛋白Bax的表达,同时增加了 PARP剪切带和p53蛋白的表达。5.统计学分析数据分析和作图均采用GraphPad Prism 5.0(数据分析和作图软件)软件。研究结论:1.设计合成了 10个2,4-二氨基嘧啶化合物,这些化合物均采用1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS及元素分析进行了结构表征;2.化合物I-7显著性抑制人结肠癌细胞株HCT 116、人宫颈癌细胞株Hela、人前列腺癌细胞株PC-3和人肝癌细胞株Hep G2四种肿瘤细胞的活力,其IC50在0.4-46 μM;3.化合物Ⅰ-7抑制CDK1/CyclinB1复合物使HCT 116和Hela细胞阻滞G2/M期;4.化合物Ⅰ-7能下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,引起下游的PARP蛋白被活化,从而诱导细胞发生凋亡;5.化合物I-7诱导HCT 116和Hela发生细胞周期阻滞和凋亡的作用与调控细胞周期的关键因子p21 waf1/Cip1和p53蛋白有关。