论文部分内容阅读
背景：肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在国内和国际上已位居各种恶性肿瘤的首位。其中非小细胞肺癌占肺癌的80%。造成肺癌死亡率居高不下的最主要的原因是缺少准确的早期诊断及有效的治疗效果监测手段。由于肺癌早期没有明显症状，80%以上的肺癌患者到医院就诊时已属晚期，失去了外科手术和多学科根治治疗的最佳时机。加之肺癌的预后较差，总体5年生存率只有10-15%。即便是I期的非小细胞肺癌（Non Small Cell Lung Cancer，NSCLC），手术治疗后仍有约30％的患者死于肿瘤复发和(或)转移。自身免疫抗体是机体免疫系统针对以基因结构和功能异常为实质的一系列病理变化所产生的免疫应答产物。作为一种新型的肿瘤标志物，自身免疫抗体在血液中表达水平的变化能够直接或间接反映病理状况的改变，也是导致具有相同组织病理类型和分期的肿瘤患者表现不同预后，或不同治疗反应原因之一。本实验拟将噬菌体展示技术与蛋白质芯片技术相结合，利用筛大量已存的NSCLC患者血清及随访结果选出新型NSCLC高敏感性和特异性的血清自身免疫抗体作为分子标志物用于NSCLC的预后评价。方法：1.提取5份非小细胞肺癌（Non Small Cell Lung Cancer，NSCLC）术后肿瘤组织总RNA，纯化mRNA并构建T7噬菌体cDNA文库。2.利用NSCLC预后良好和不良患者血清对T7文库进行生物淘洗，挑选出1268个肿瘤特异性的T7单克隆构建蛋白芯片。3.构建蛋白芯片，并分别用23分预后良好患者血清和34分预后不良血清孵育芯片并进行Cy5/Cy3双荧光标记。4.分析扫描芯片所得数据，筛选出能够区分预后良好和不良血清的诊断标志物组合并进行留一法验证其准确性。5.对肿瘤特异性的T7插入序列进行PCR测序，Blast所得DNA序列并进行分析。结果：1.成功构建非小细胞T7噬菌体cDNA文库，滴度检测表明原始文库滴度为3.7×106pfu/mL。随机挑取96个噬菌斑进行PCR检测，结果表明文库的重组率为95%，符合质量要求。2.文库经扩增，滴度检测为7×1010pfu/mL。随机挑取96个噬菌斑进行PCR检测，结果表明文库重组率为95%，97.9%克隆（插入片段）大于250bp，10.5%克隆大于750bp。生物淘洗后随机挑选96个克隆进行PCR，结果表明淘洗后文库重组率为98%，92.9%克隆大于250bp，18.4%克隆大于750bp。淘洗后重组率明显提高，并且含有大片段的克隆得到明显富集。3.构建的蛋白芯片经Cy5、Cy3双荧光检测系统及统计学筛选分析芯片后，得到最佳评价组合含6个NSCLC预后相关标志物，其联合诊断准确率达到80.7%，敏感性为85.3%，特异性为73.9%，AUC为0.825。测序及Blast分析表明其中3个标志物是已知癌细胞转移和预后相关分子，分别是abl-interactor1(ABI1)，pleiotrophin (PTN)和surfactant protein B (SFTPB)。另外3个标志物都是人基因组中未研究过的基因。结论：成功构建非小细胞肺癌T7cDNA文库，经淘洗和生物芯片筛选得到一个含有6个标志物的预后评价组合能够对肺癌预后进行较准确的诊断，丰富了非小细胞肺癌预后不良标志物的种类，提供了一种利用血清来达到非小细胞肺癌预后评价的一种方法并为癌症的治疗奠定了一定基础。