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第一部分:JNKs蛋白在各阶段植入前小鼠胚胎中的表达目的:了解JNKs蛋白在各阶段小鼠着床前胚胎中的表达规律:方法:实验动物为昆明种小鼠,经过药物促排卵后,分别获取妊娠0.5天(合子),1.5天(二细胞期),2.5天(融合期桑椹胚),3.5天(早期囊胚)的胚胎;使用JNK多克隆抗体,通过免疫荧光法结合激光共聚焦技术,在蛋白水平上定性且半定量检测个阶段鼠胚内JNKs蛋白的表达,并且初步找出其中规律结果与结论:1.在各阶段的小鼠胚胎细胞的胞浆内均有JNKs蛋白的表达;2.随着胚胎的发育,JNKs蛋白表达呈上升趋势,其中在妊娠1.5天(2细胞阶段)到妊娠2.5天(融合期桑椹胚阶段)上升最为明显(荧光强度3176.9±446vs 1297.2±392.3,P<0.05):第二部分外界培养环境与小鼠早期胚胎细胞内JNKs分子的激活目的:探讨体外培养环境及其内各种刺激因素对小鼠胚胎细胞内JNKs分子激活的影响方法:1.分别获取体内及体外的妊娠第3.5天的小鼠胚胎(早期囊胚阶段),以免疫荧光和Western-Blotting的检测方法,比较两者细胞内JNKs分子的激活(磷酸化)水平;2.以免疫荧光法比较不同温度下(35摄氏度,37摄氏度,39摄氏度)培养9小时后小鼠着床前胚胎(早期囊胚期)细胞内JNKs分子的激活水平。3.以免疫荧光法比较在3种不同培养液(CZB,G-1,G-2)中培养48小时后的小鼠胚胎细胞内JNKs分子的激活水平;4.以免疫荧光法比较在不同培养密度下(<3个/25ul;15-25个/25ul与>50个/ul)培养48小时后小鼠胚胎细胞内JNKs分子的激活水平。结果:1.体外培养的小鼠胚胎细胞内JNKs分子的激活水平显著高于体内发育者。(免疫荧光法与Western-Bloting法比较均有统计学意义)2.而在39摄氏度培养下9小时后的鼠胚细胞内JNKs分子的激活水平明显高于35与37摄氏度组(P<0.05);3.而使用CZB培养液培养的胚胎细胞内激活的JNKs分子的荧光密度显著高于G-2培养液组(P<0.05)4.而在25微升的液滴中,当培养密度〉50个胚胎/液滴时,细胞内激活的JNKs分子的含量显著增加,较另外两组差异有统计学意义(P<0.05)结论:1.体外培养的小鼠胚胎细胞内JNKs分子的激活水平高于体内发育者;2.培养温度,培养液的成分以及培养密度的变化局可以影响小鼠胚胎细胞内JNKs分子的激活。第三部分:JNKs分子的激活与小鼠早期胚胎的发育与凋亡目的:探讨JNKs分子的激活与小鼠胚胎细胞凋亡之间的关系:方法:1.比较在培养液内加入不同浓度(10uM,20uM与50uM)或在不同时间内(妊娠1.5天到2.5天与妊娠2.5天到妊娠3.5天)加入JNKs激活的特异性抑制剂SP600125对小鼠胚胎囊胚形成率的影响;2.取妊娠3.5天的小鼠早期囊胚,以TUNEL标记法比较培养液加入或不加入SP600125的情况下,热处理(41摄氏度)6小时后小鼠囊胚细胞的凋亡比例;3.取妊娠1.5天的小鼠胚胎,以线粒体膜电位荧光探针JC-1染色法,比较加入或不加入SP600125的情况下,热处理(41摄氏度)1小时后胚胎细胞内线粒体膜电位的改变;4.同上法,比较加入或不加入SP600125的情况下,热处理3小时后小鼠胚胎细胞内Caspase-3蛋白表达水平的差异;结果:1.培养液中添加不同浓度SP600125后,囊胚形成率有所上升,其中当SP600125浓度为20uM是囊胚形成率最高,达72.3%,培养液中在妊娠1.5-2.5天时(卵裂球融合前)添加SP600125比妊娠2.5-3.5天时(卵裂球融合后)添加SP600125的囊胚形成率更高,但以上差异均未见统计学意义;2.在培养液中加入20uM浓度的SP600125时,可显著降低热处理后小鼠囊胚中调亡的细胞比例(39.27±7.15 Vs 64.97±8.23,P<0.05):3.在培养液中加入20uM浓度的SP600125时,热处理1小时后胚胎膜电位丧失的线粒体比例显著下降(P<0.05)4.在培养液中加入20uM浓度的SP600125时,热处理后3小时的胚胎细胞内Caspase蛋白表达的水平明显下降(P<0.05)结论:1.JNKs分子的激活可能影响小鼠胚胎进一步的发育潜力;2.外界刺激引起的JNKs分子的激活可以促进小鼠胚胎细胞的凋亡过程;3.JNKs促进胚胎细胞凋亡的机制可能与线粒体依赖的凋亡途径有关。