研究背景骨肉瘤(OS)是在儿童及青少年中最常见的骨肿瘤之一。化学治疗是骨肉瘤的主要治疗方法。在骨肉瘤中,肿瘤血管生成作用与肿瘤的增殖、转移密切相关,与化疗敏感性及患者的预后呈负相关。而治疗失败的重要原因与肿瘤细胞化疗药物耐药性的产生密切相关。因此,提高骨肉瘤化学治疗敏感性是延长患者生存期的有效途径。脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(APE1)参与调控骨肉瘤的化疗敏感性,是肿瘤细胞化疗抵抗的重要调节基因。在OS中,APE1的表达通常增高,并且与骨肉瘤血管生成正相关,与化疗药物敏感性、预后呈负相关。MiRNAs具有抑癌或者促癌的双重作用,通过作用靶基因参与肿瘤调控。我们通过miRNA高通量芯片技术,检测APE1野生型和稳定敲低型的人骨肉瘤HOS细胞株的差异表达谱,发现miR-765在芯片中上调显著(上调>5倍),生物信息学预测提示miR-765具有APE1 3’UTR区的结合位点。在目前的研究中,我们发现miR-765能够靶向结合APE1,并抑制APE1的表达及其DNA损伤修复能力,提高骨肉瘤化疗敏感性。同时发现miR-765联合顺铂不仅抑制APE1,还能显著抑制血管生成相关因子VEGF,FGF2、TGFβ及MVD的水平,从而提高骨肉瘤细胞化学治疗敏感性。在小鼠模型中,miR-765能够明显抑制移植瘤的生长,促进肿瘤细胞凋亡。临床资料显示,miR-765阳性表达的患者,较阴性表达的能够获得更长的生存期,而APE1阳性表达的骨肉瘤患者则恰恰相反。综上所述,目前的数据表明miR-765能够靶向结合APE1,并抑制其表达及DNA损伤修复功能,增强顺铂在骨肉瘤细胞中的抗血管生成作用,从而提高骨肉瘤化疗敏感性,为骨肉瘤研究提供了新的生物标记和治疗靶标。研究目的1.证实APE1是miR-765下游的直接靶基因,确定二者特异性作用位点;miR-765作用于APE1,抑制其DNA损伤修复功能,提高骨肉瘤化疗敏感性。2.证实miR-765通过抑制APE1,增强顺铂在骨肉瘤细胞中的抗血管生成作用,提高治疗敏感性。研究方法1.收集骨肉瘤患者的临床资料、组织样本共43例。2.运用生物信息学分析、载体构建、双荧光素酶报告基因实验(Dual luciferase report genesystem)以及Western blot验证APE1是miR-765下游的直接靶基因。3.运用Western blot、CCK-8、γ-H2AX实验技术验证miR-765抑制APE1表达,降低其DNA损伤修复能力,提高骨肉瘤细胞化疗敏感性。4.运用RT-PCR、Western blot实验技术验证miR-765联合顺铂抑制APE1,VEGF,FGF2,TGFβ的表达;运用Transwell和管状形成实验检测miR-765联合顺铂对骨肉瘤细胞血管生成能力的影响。5.运用动物模型,检测miR-765对移植瘤的生长影响;运用免疫组化(IHC)检测瘤体组织APE1,VEGF,FGF2,TGFβ、CD34表达情况。6.运用免疫组化(IHC)和原位杂交(ISH)分别检测人骨肉瘤中APE1及miR-765表达状况,评估两者在骨肉瘤患者中的相关性,对患者预后的影响。研究结果1.MiR-765在骨肉瘤细胞中能够靶向结合APE1,且与APE1的表达呈负相关。2.MiR-765抑制APE1的DNA损伤修复能力,提高骨肉瘤顺铂治疗敏感性。3.MiR-765联合顺铂在骨肉瘤细胞中,能够显著抑制肿瘤血管生成相关因子的表达,增强顺铂抗血管生成作用。4.小鼠实验表明,miR-765能够抑制移植瘤的生长。5.临床数据显示,miR-765阳性表达的患者,较阴性表达的患者能够获得更长的生存期,而在APE1阳性表达的患者中,其生存期小于阴性表达的患者。结论1.发现在骨肉瘤中,miR-765能够靶向结合APE1的3’UTR区,在体内、体外均抑制APE1的表达,影响肿瘤细胞DNA损伤修复;且miR-765通过对APE1的抑制增强顺铂在骨肉瘤细胞中抗血管生成作用,提高骨肉瘤化疗敏感性,miRNAs调控APE1的机制研究为APE1抑制剂的研究提供了新的探索方向。2.对骨肉瘤患者而言,miR-765阳性表达相对阴性表达的患者,能够获得更长的生存期,可作为预后的评估指标之一。