桑树是多年生落叶性木本植物,经过长期的自然选择和人工选择,形成了我国丰富的桑树种质资源,其中一些高抗冻性的桑树资源,即使在-30℃的条件下也能正常生存,这些资源为桑树抗寒育种提供了遗传基础。在此以前,对桑树抗冻、抗寒性研究大多停留在抗性指标的测定上,从未涉及到低温逆境的分子水平和低温响应的研究领域。由于桑树等木本植物的生活周期长,目前尚没有足够的遗传群体进行分析,特别是冷相关基因的克隆及调控方面的报道极为鲜见。本研究探讨了不同桑树品种对低温逆境的反应,克隆了低温诱导的相关基因并进行分析和转化研究,为分子水平的桑树遗传改良和抗性育种奠定了一定基础。主要研究如下：1.利用人工低温驯化的方法从32个桑品种中筛选出5个抗寒性较强的品种。用枝条作插穗,发芽后在3℃-0℃的驯化条件下,蒙古桑表现出更强的抗寒性。2.以蒙古桑嫁接苗为材料,取鹊口期桑芽经3℃诱导48 h后,提取幼茎(不含茎顶)RNA反转录合成cDNA,利用RT-PCR技术获得了1条681 bp的cDNA序列。利用生物信息学软件和数据库资源对获得的cDNA及其推演蛋白进行了生物信息学分析。结果表明,该序列具有一个完整的编码框(ORF),编码226个氨基酸。该序列提交GenBank,收录号为DQ104333。推演蛋白的推测pI值是5.32,分子量为25.3 kDa。由此将该蛋白命名为WAP25。进一步分析发现,推演蛋白226个氨基酸中,疏水性氨基酸占相当大的比例,其中丙氨酸(A)35个,占15.5%；赖氨酸(K)31个,占13.7%；谷氨酸(E)29个,占12.8%。这3种氨基酸占总量(226个)的42%。有11个氨基酸构成的同感序列(T**KAKEKA*D/E)前后重复12次,这种多次重复正是植物胚胎后期富集蛋白(LEA3)的特征,WAP25属于低温诱导蛋白。另外,该蛋白N端区1-33位具有典型的信号肽结构特征,暗示WAP25属于分泌型蛋白。3.将目的片段与原核表达载体pET-28a连接,构建重组质粒pET28/Wap25,转化E.coli BL21后,在E.coli BL21中得到有效表达。表达产物SDS-PAGE电泳在28 kDa附近有一特异条带,表明WAP25与pET-28a融合表达产物的大小与预测的一致,Western blotting检测也得到了相同结果。4.将目的片段与植物表达载体pIG121-Hm构建重组质粒pIG121/Wap25,并转化根癌农杆菌LBA4404,获得对4种抗生素(Kan、Hm、Str和Rif)有抗性的工程菌LBA4404/pIG121/Wap25,感染矮牵牛的叶盘后在部分个体中出现绿色芽,进而分化出不定芽,60 d后获得了34株抗Kan和Hm的组培苗。提取抗性苗基因组DNA,以此为模板进行Wap25基因的PCR扩增和Southern检测,在8株抗性苗中有4个为阳性,初步表明Wap25基因已经导入矮牵牛中,两批的转化率为11.48%。5.以菌株A-110 (LBA4404/pIG121-Hm)为工程菌,用植株转化技术对真叶开放期的桑苗进行了转化研究。在农杆菌残留检测的试验中发现,用农杆菌浸染后的叶片残有一定的菌体；而用PCR检测感染株中残存菌的VirA基因时,VirA基因没有得到扩增,表明感染株中没有农杆菌残留。进一步研究表明：感染后的植株出现较多的畸形叶片,对畸形株进行PCR、Southern和GUS染色检测,都得到了阳性信号或反应,表明植株转化法也可以实行桑幼苗外源基因(β-葡萄糖苷酸酶GUS)的转化。