目的:中医学基本理论认为,脾脏“为后天之本”“气血生化之源”,是提供后天生命活动所需物质最重要器官。而“脾主运化、统血”是脾脏的核心功能。现代医学已明确,维系生命活动最基本物质是三磷酸腺苷(ATP)为代表的能量物质。而ATP的来源与生成则包括了物质的消化与吸收、血液的运输、跨膜物质转运以及以线粒体为平台的氧化磷酸化等生物学过程。因此,“脾主运化、统血”功能与现代医学能量代谢的生物学过程有着密切的内在联系。但中医学理论认为,“脾主运化与统血”是脾脏象的两个不同核心功能,“脾统血”包含了“生血、行血、摄血”作用。我们根据中医学理论与现代医学能量代谢的生物学过程及其机制,认为脾生血应与血液成分的生成有关;脾摄血则与止血和凝血机制有关。而对于“行血”则提出以下科学假说:“脾统血”功能可能属于“脾主运化”功能的一部分,即物质消化与吸收后,通过血液循环系统向全身组织细胞输送的部分功能,其机制可能是脾气虚导致了BNP的变化,进而影响了c AMP-PKA通路,导致心功能发生了变化。本工作目的,运用电生理学及分子生物学技术,观察脾气虚证模型大鼠心功能变化,并探讨其可能的分子生物学机制,旨在阐明中医学“脾主运化、统血”,特别是“运化”与行血功能之间关系的科学内涵同时,为临床“从脾论治”心血管疾病提供实验依据。方法:1.实验动物与分组由本溪实验动物中心(辽宁长生生物科技有限公司)购入30只SPF级雄性SD大鼠,体重200±10g,许可证号SCXK(辽-2010-0001),进行一周时间适应性饲养后,随机分为正常组和脾气虚模型组两组,每组各15只。2.脾气虚证模型复制与评价:大鼠脾气虚证模型复制方法根据中医学病因基本理论,参照《中药新药临床研究指导原则》[1]和《中医实验动物模型方法学》[2]中制备脾虚模型的方法,运用饮食不节加劳倦内伤复合因素复制脾气虚证大鼠模型。即24小时自由饮食水,禁食不禁水48小时;同时每天进行游泳25分钟,水温在35℃~37℃之间,室温保持在23±1℃;连续造模2周后进行模型评价。脾气虚证模型成模评价方法:依据文献[3]分别对模型大鼠宏观表征主要症状,神疲、乏力、食少纳呆、身体消瘦、便软腹泻等进行了量化,剔除没有达到标准大鼠。正常组正常饮食水,没有施加刺激因素。3.核心指标检测方法3.1左心功能检测:采用小动物超声影像系统进行大鼠心功能检测;该系统由加拿大Visua Sonics公司购入,型号VEVO2100超高分辨率。于模型组造模成功后,禁食24小时,分别检测正常组及模型组大鼠左心功能,检测部位选择大鼠房室环,参照小动物超声心动图仪器内部设定的的心电图既有模式连接仪器。连接完成后,调整仪器参数:动态量程(Dynamic range),60d B;显示地图(Display map),CS;扫描速率(Sweep speed),1000Hz;对等(Contrast),50;亮度(Brightness)50。等待大鼠呼吸平稳,心电图能够清楚的展现出来后,开始记录大鼠10秒钟的超声心动图,仪器随机从10秒钟的片段中选取3段进行测量,给出平均值,从而获得各组大鼠的左室射血分数(LVEF)、左室收缩末期容积(ESV)、左室每搏输出量(SV)、左室舒张末期容积(EDV)的平均值。3.2.取材及分子生物学指标检测:取材方法:实验结束后,两组大鼠禁止饮食24小时,选用20%氨基甲酸乙酯溶液对大鼠进行麻醉,大鼠腹部备皮,解剖,5ml注射器抽取大鼠腹主动脉血;随后用医用剪刀剪开胸腔后,取大鼠心脏,医用手术刀迅速切取心脏组织,根据检测指标要求分别进行采血即组织样本制备。采用常规HE染色方法观察心脏组织形态学变化;透射电镜检测心肌组织细胞形态学改变。采用Elisa法测定血清及心肌组织BNP、c AMP的含量;采用免疫组化法测心肌细胞BNP受体蛋白的表达。采用蛋白质印迹法(Western Blot)测定心肌中BNP的表达;采用Q-PCR方法检测b FGF、PKA m RNA表达。4.统计方法:本实验所有数据统计学分析处理都由SPSS 13.0统计软件进行,并用均数±标准差(`x±s)的方式表达数据结果,采用校正t检验(方差不齐时)或独立样本t检验(方差齐时)比较计量资料,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.大鼠心功能检测结果:与正常组比较,脾气虚证模型组大鼠心脏左室收缩末期容积(ESV)数值明显升高(P<0.05);而左室舒张末期容积(EDV)、左室射血分数(LVEF)、左室每搏输出量(SV)则明显低于正常组(P<0.05)。2.心肌组织HE染色结果:正常组大鼠心肌细胞纤维结构显示较为清楚、心肌纤维排列方式整齐、心肌细胞横向纹路清晰,并无出现炎症细胞的浸润现象,心肌细胞结构为正常;脾气虚证模型组大鼠心肌萎缩,细胞排列方式紊乱、细胞坏死,存在细胞脂肪变性及浑浊等变化。3.心肌组织透射电镜检测结果:正常组心肌细胞排列正常,肌膜结构清晰,心肌纤维排列尚规则,Z线可见。肌纤维内线粒体丰富,结构完好,线粒体无肿胀、变性及坏死;间质未见纤维组织增生及炎细胞浸润。模型组肌纤维排列疏松(水肿),偶见闰板分离,部分肌丝溶解;肌丝A带、I带结构不清,Z线仍可见;线粒体较丰富,但大小不一,线粒体基质电子密度增高。4.BNP、c AMP含量检测结果:与正常组比较,脾气虚证模型组大鼠血清及心肌组织中BNP、c AMP含量均明显升高,具有统计学意义(P<0.05)。5.BNP受体表达检测结果:大鼠心肌组织中BNP受体表达,多见于细胞膜,细胞胞浆亦有表达但较少,呈棕黄色为阳性表达。正常组大鼠心肌细胞染色表现为弱阳性,而脾气虚证模型组的阳性物表达的细胞数明显多于正常组;与正常组比较,脾气虚证模型组其心肌细胞中BNP的IOD值明显升高,且差异具有统计学意义(P<0.05)。6、PKA与b FGF m RNA表达检测结果:目的基因得到有效扩增,因目的基因的扩增曲线走势符合S型曲线。熔解曲线中显示没有出现杂峰,只有一个峰值,说明目的基因的定量测定可以采用该体系。对比两组间PKA及b FGF m RNA的表达情况,脾气虚证模型组比正常组具有明显的增加(P<0.05)。本实验结果显示,脾气虚证模型大鼠的“脾主运化”功能损伤时,其左室收缩末期容积增大,舒张末期容积、每搏输出量等均发生变化,特别是左心射血分数发生改变,表明脾气虚“运化”功能发生障碍时,心脏射血功能也明显受到影响,即表现为“行血”功能下降。本结果支持了“脾统血”功能可能属于“脾主运化”功能一部分的假说。总结本实验结果可以认为,脾气虚证,“脾主运化”功能失职时其“统血”功能也受到影响,其可能机制之一是由于心肌组织BNP及其受体表达上调,激动了c AMP-PKA通路并通过b FGFm RNA过度表达,从而造成心肌组织形态学发生改变,最终导致其左心室射血功能下降。结论:1、脾气虚证模型大鼠左心室射血功能明显降低。其中左室收缩末期容积(ESV)升高;左室舒张末期容积(EDV)、左室射血分数(LVEF)、左室每搏输出量(SV)则明显降低。2、脾气虚证模型大鼠心肌组织萎缩,炎症细胞浸润、其肌纤维排列紊乱、肌丝与核发生溶解;线粒体大小不均。3、脾气虚证模型大鼠心肌组织与血清中BNP含量增加,其心肌细胞BNP受体表达上调。4、脾气虚证模型大鼠心肌组织c AMP含量升高、PKA及b FGFm RNA表达上调。