论文部分内容阅读
高尔基体蛋白73（Golgi protein 73,GP73）是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）早期诊断和筛查的一种新型肝癌标志物。本论文以GP73痕量检测为目的,以适配体为识别分子,结合比色法简单直观和电化学法响应快速的优势,引入多功能探针并结合类酶催化放大技术,构建了基于氧化锰基纳米酶（血红素-还原氧化石墨烯-四氧化三锰,H-rGO-Mn3O4）电化学/比色双模式适配体传感平台,实现了对血清中GP73的准确灵敏分析。本论文主要研究内容分为以下几个方面:（1）H-rGO-Mn3O4纳米酶的合成及性能研究:采用两步合成法制备H-rGO-Mn3O4纳米酶,通过傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectrometer,FT-IR）、X射线衍射（X-ray diffraction,XRD）、紫外-可见分光光谱（Ultraviolet–visible spectroscopy,UV-vis）、X射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy,XPS）、扫描电镜（Scanning electron microscope,SEM）、透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）、粒径以及Zeta电位等表征技术验证H-rGO-Mn3O4纳米酶合成成功,同时对H-rGO-Mn3O4纳米酶的性能进行分析,验证其拟酶性能。（2）比色适配体传感器检测GP73的研究:采用圆二色谱优选出两条GP73适配体（Aptamer1,Apt1、Aptamer2,Apt2）,将氨基修饰的Apt1通过π-π吸附固定在H-rGO-Mn3O4纳米酶表面作为检测探针;同时以Apt2作为捕获探针,构建基于H-rGO-Mn3O4纳米酶的GP73比色适配体传感器。H-rGO-Mn3O4纳米酶催化H2O2氧化底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine,TMB）,使得体系溶液由无色变成蓝色,从而实现对GP73的可视化检测。在最优条件下,GP73浓度（0.05-50.0 ng/mL）对数与吸光度呈良好的线性关系,校准方程为Y=-0.0383 lgCGP73+0.4835,R~2=0.9964,最低检测限（Limit of detection,LOD）为36.94 pg/mL（S/N=3）。直接检测实际血清样本中GP73的含量,相对标准偏差（Relative standard deviation,RSD）在0.49%-4.91%之间,与临床的酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）方法相比,其相对误差在0.23%-3.61%之间。此外,传感器还具有优良的特异性、稳定性和重现性。（3）双信号夹心型电化学适配体传感器检测GP73的研究:金@聚邻苯二胺（Gold@Poly-o-phenylenediamine,Au@POPD）修饰在丝网印刷电极（Screen printed electrodes,SPE）表面以固定Apt2。H-rGO-Mn3O4-Apt1作为检测探针,成功设计了检测GP73的夹心型电化学适配体传感器。H-rGO-Mn3O4中的hemin（Fe（Ⅲ））/hemin（Fe（Ⅱ））之间具有可逆的氧化还原反应可用作一种原位信号指示剂,TMB作为另一种信号探针,采用方波伏安法（Square wave voltammetry,SWV）检测并记录两种电信号。在最优条件下,TMB氧化电流信号和hemin氧化电流信号的差值均与GP73浓度（0.01-100.0 ng/mL）对数呈良好的线性关系。TMB信号电流响应的校准方程为ΔITMB=6.2723 lgC+14.6864,R~2=0.9937,hemin信号电流响应的校准方程为ΔIhemin=1.8634 lgC+5.7833,R~2=0.9956,LOD为7.1 pg/mL（S/N=3）,灵敏度为2.442μA/μM/cm~2。同时,传感器还具有良好的特异性、重现性和稳定性。采用加标法检测实际血清中GP73的含量,回收率在98.66%-121.11%之间。（4）电化学/比色双模式适配体传感器检测GP73的研究:采用AuNPs修饰SPE,将Apt1的互补链（cDNA）固定在AuNPs/SPE电极表面;Apt1固定在H-rGO-Mn3O4纳米酶表面作为检测探针;利用cDNA和GP73与检测探针之间的竞争作用,采用TMB作为电化学和比色的双功能探针以及类酶催化放大的信号放大方式,构建了基于H-rGO-Mn3O4纳米酶的GP73电化学/比色双模式适配体传感器。在最优条件下,GP73浓度（0.0001-100.0 ng/mL）对数与SWV电流变化值和吸光度均呈良好的线性关系,电化学模式的校准方程为Y=3.1696 lgC+24.9896,R~2=0.9963,比色模式的校准方程为Y=-0.0417 lgC+0.3386,R~2=0.9931。LOD为0.1 pg/mL。构建的双模式传感器具有良好的抗干扰能力以及优良的稳定性和重现性。通过直接测量法检测血清样本中GP73的浓度,电化学方法的RSD值在1.43%-5.93%范围内,与ELISA方法的相对误差在0.39%-4.07%范围内;而比色方法的RSD值在2.58%-6.79%范围内,与ELISA方法的相对误差在0.22%-5.48%范围内,从而验证了该方法的适用性。（5）三种适配体传感器比较:与制备简单、成本低、可通过肉眼检测靶标的比色适配体传感器相比,电化学适配体传感器具有较高的灵敏度,较宽的线性范围和较低的检测限,并且实现了靶标的双信号检测,降低了误诊和漏诊的可能性。相较于单一电化学或比色法,电化学/比色双模式适配体传感器,不仅具有更宽的检测范围,更低的检测限,而且具有较高的精准度和准确性。