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研究背景及目的:细胞凋亡参存在于机体的整个生命过程,参与了生命过程中的各种生理及病理过程。细胞凋亡的增加或者减少是许多疾病的发病基础。目前研究发现,内质网除了参与机体正常的生命活动,也参与了细胞的凋亡过程,内质网凋亡途径成为新的凋亡通路。内质网凋亡通路的主要机制是各种理化因素导致的内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。内质网在细胞生命过程中发挥重要作用,其主要功能是参与蛋白质的折叠、修饰及合成。当内质网受到内外理化因素刺激时,会导致蛋白质的代谢及合成障碍。当理化因素强烈、持续存在时,内质网稳态紊乱,积累大量的未折叠或折叠错误的蛋白质后,会激活内质网凋亡途径,进而导致细胞凋亡。当椎间盘髓核组织中髓核细胞大量凋亡时,即可引起椎间盘退变,进而导致一些列脊椎退行性疾病的发生。本研究旨在通将髓核细胞培养于含有高浓度葡萄糖的培养基中,探讨在高糖环境中,ERS是否参与诱导兔髓核细胞的凋亡过程。方法:本实验采用胰酶联合Ⅱ型胶原酶消化法,体外分离、培养兔髓核细胞,经过甲苯胺蓝染色、苏木精-伊红染色后观察细胞形态。通过细胞免疫组织化学染色、免疫荧光染色鉴定髓核细胞后,将第三代兔髓核细胞随机分为四组,包括:对照组(正常培养基组)、高糖组(培养基中含有100m M葡萄糖)、Caspase-12抑制剂组(培养基中含有2μM氟甲基酮)和高糖+Caspase-12抑制剂组(培养基中含有2μM氟甲基酮及100m M葡萄糖),每组细胞按照不同的实验条件处理6h后,分别采用CCK-8试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒检测各组细胞的增殖活性及凋亡情况,ROS检测试剂盒检测各组细胞内的总活性氧(reactive oxygen species,ROS),PCR和Western-blot检测各组Caspase-12和Grp78的表达变化。结果:成功完成了兔髓核细胞的体外分离培养;髓核细胞染色后镜下观察呈多角形、短梭形,有一到两个核仁,随着传代次数增加,细胞伸出伪足,胞体逐渐变细长;体外分离培养髓核细胞可稳定表达Ⅱ型胶原蛋白。高糖组细胞增殖活性明显受抑制,细胞内ROS及凋亡率明显增加,Caspase-12和Grp78表达量较对照组明显增加;氟甲基酮可以降低高糖诱导的细胞凋亡率、Caspase-12及Grp78的表达。结论:1.ERS通过激活内质网Caspase-12凋亡通路参与了高糖诱导髓核细胞凋亡的过程;2.高糖诱导的ROS过量产生及积累是引起ERS的主要因素之一。