玉米卷叶突变体Rld3的鉴定、基因定位及克隆

来源 :四川农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wenty2008
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玉米叶型不仅直接影响光合效率和籽粒中干物质的积累,也影响株型及种植密度,因此玉米叶型是决定玉米单位面积产量的一个重要因素。一定程度的叶片卷曲可以增加植株底部叶片的受光面积,因此对玉米卷叶突变体的研究不仅可以解析玉米叶片发育和叶片极性建成的分子机理,还对玉米株型遗传改良和提高玉米单位面积产量具有重要的理论意义。本研究利用EMS诱导四川农业大学玉米研究所骨干自交系RP125而筛选得到1份卷叶突变体,暂命名为rolled leaf 3(Rld3),并对Rld3进行了各农艺性状的考察,光合指标、叶绿素含量等生理指标的测定,以及叶片组织细胞学观察。同时利用图位克隆与BSR-seq相结合的手段对显性卷叶突变体Rld3进行基因克隆,并结合RNA-seq数据初步分析了候选基因的功能。取得的研究成果如下:1.表型调查发现,突变体Rld3在4-6叶期出现叶片向上卷曲的表型,并持续整个生育期;除其叶长显著高于野生型外,株高、穗位高、叶宽等性状均显著小于野生型;此外,Rld3籽粒无胚,粒长、粒宽、粒厚、百粒重等性状均显著降低。对突变体的光合指标、叶绿素含量进行测定,结果表明,Rld3的叶绿素含量和净光合速率(Photo)均极显著低于野生型,胞间二氧化碳(Ci)的含量与净光合速率成反比。组织细胞学观察发现Rld3叶片下表皮气孔数量减少,上表皮细胞萎缩缺失,下表皮缺少蜡质层表皮细胞且排列不规则,泡状细胞排列不规则并且数量变多,但体积变小,叶肉细胞排列紊乱。2.在Rld3与B73和RP125分别构建的BC1F1回交群体中,正常叶和卷片的分离比均符合1:1的理论比例;表明该突变表型由单一显性基因控制。3.利用B73×Rld3 F2代分离群体以及BC1F1回交群体进行基因定位,结合BSR-seq与BSA进行初定位,将候选区段定位于玉米3号染色体(chr3)的标记mmc0132和bnlg1456之间;进一步以1230个隐性单株精细定位于J-112与J-90标记之间,区段大小222 kb。通过对区段内的候选基因进行序列比对发现Zm00001d041489基因第二个外显子与第三个内含子之间的“G”碱基突变为“A”碱基,推测该突变与m RNA的可变剪切有关,并进一步证明该突变位点与表型共分离,将之初步确定为候选基因。测序发现突变体Rld3的m RNA存在12 bp缺失,该12 bp刚好是mi RNA166的靶位点关键序列,推测该突变造成RLD3异位表达,从而使得叶片极性发育异常。4.系统进化树分析表明,与RLD3同源性最高的为高粱中的SORBI_3008G168100。在玉米中存在7个同源基因,与已报道的RLD1不属于同一分支。蛋白保守性分析表明,缺失的V-G-M-K这4个氨基酸中有3个(G-M-K)氨基酸在单子叶、双子叶植物中是绝对保守的。表达谱分析表明,候选基因RLD3存在组织特异性表达,在胚芽组织中表达最高,在叶片和植株发育的中后期几乎无表达,表明该基因表达存在时空特异性。亚细胞定位结果表明,RLD3可能在叶绿体中表达。5.转录组数据分析发现:突变体与野生型相比叶片发育过程中共有507个基因存在差异表达,其中上调表达基因主要与植物抗性和单萜类物质合成相关,下调表达基因主要涉及转录后水平的可变剪切、光合作用关键伴侣蛋白以及调节生长素运输相关蛋白。另外KEGG分析表明,双萜类的GA生物合成途径能够显著富集。Rld3突变体中由于RLD3基因突变造成了玉米叶片卷曲,纯合突变体致死的表型,不难看出RLD3基因在玉米叶片极性发育和胚发育过程中起至关重要的作用。因此研究Rld3突变体对提高玉米产量和玉米株型遗传改良具有重要意义。
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